एक प्रोटीन प्रोटीन की उच्च throughput पहचान नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण का प्रयोग एक परमाणु cofactor साथ बातचीत के लिए तैयारी विधि
Summary
हम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस प्रणाली का उपयोग कर coregulatory बातचीत प्रोटीन की शुद्धि के लिए एक विधि की स्थापना की है।
Abstract
Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.
Introduction
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत में कई जैविक कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जैसे, इन मुलाकातों संकेत पारगमन में फंसाया गया है; कोशिका झिल्ली भर में प्रोटीन परिवहन; सेल चयापचय; और डीएनए प्रतिकृति, डीएनए की क्षति की मरम्मत, पुनर्संयोजन, और प्रतिलेखन 1, 2, 3, 4 सहित कई परमाणु प्रक्रियाओं। इन मुलाकातों में शामिल प्रोटीन की पहचान करना इसलिए इन सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है।
Immunoprecipitation (आईपी) प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल एक मान्य तकनीक है। आदेश सह immunoprecipitated प्रोटीन की पहचान की सुविधा के लिए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री अक्सर उपयोग किया जाता है 5, 6, 7, 8,9। एक एंटीबॉडी के साथ एक प्रोटीन परिसर के एक ज्ञात सदस्य को लक्षित करके, यह प्रोटीन जटिल अलग-थलग करने और बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से अपनी अज्ञात घटकों की पहचान करने के लिए संभव है। ARIP4 (एण्ड्रोजन रिसेप्टर बातचीत प्रोटीन 4), एक ट्रांसक्रिप्शनल coregulator, आदेश में सक्रिय या एक संदर्भ पर निर्भर ढंग से 9, 10 में अपने लक्ष्य के प्रमोटरों को दबाने के लिए परमाणु रिसेप्टर प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान। बेहतर इन परमाणु कारकों गवर्निंग विनियामक तंत्र को समझने के लिए, हम शुद्ध और नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस प्रणाली का उपयोग करके ARIP4 बातचीत प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक व्यापक विधि का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कुशल अभिकर्मक इस प्रोटोकॉल के साथ एक सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। तदनुसार, हम पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग immunoprecipitated झंडा टैग प्रोटीन का स्तर निर्धारित करने के लिए सलाह देते हैं। यह कदम उ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
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