Une protéine Méthode de préparation pour le haut-débit Identification des protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire utilisant LC-MS / MS Analysis
Summary
Nous avons établi un procédé pour la purification des protéines d'interaction co-régulation utilisant le système LC-MS / MS.
Abstract
Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.
Introduction
interactions protéine-protéine jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions biologiques. Par conséquent, ces interactions ont été impliquées dans la transduction du signal; le transport de protéines à travers les membranes cellulaires; le métabolisme cellulaire; et plusieurs processus nucléaires, y compris la replication de l' ADN, la réparation des dommages de l' ADN, la recombinaison et la transcription 1, 2, 3, 4. L'identification des protéines impliquées dans ces interactions est par conséquent essentiel de faire progresser notre compréhension de ces processus cellulaires.
Immunoprécipitation (IP) est une technique utilisée pour valider l'analyse des interactions protéine-protéine. Afin de faciliter l'identification des protéines co-immunoprécipitation, la spectrométrie de masse est souvent utilisée 5, 6, 7, 8,9. En ciblant un élément connu d'un complexe protéique avec un anticorps, il est possible d'isoler le complexe de protéines et d'identifier ensuite les composants inconnus par analyse par spectrométrie de masse. ARIP4 (protéine androgène-récepteur coopérant 4), un co – régulateur de la transcription, interagit avec les protéines de récepteurs nucléaires, afin d'activer ou de réprimer les promoteurs cibles d'une manière dépendante du contexte 9, 10. Pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de transcription qui régissent ces facteurs nucléaires, nous décrivons une méthode complète pour purifier et identifier les protéines qui interagissent ARIP4 en utilisant le système LC-MS / MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
transfection efficace est essentielle pour obtenir un bon résultat avec ce protocole. En conséquence, nous vous recommandons d'utiliser l'analyse Western blot pour déterminer les niveaux de protéine FLAG-tagged immunoprécipitées. Cette étape permet aux utilisateurs de vérifier que leur protéine d'intérêt est correctement surexprimée et, en outre, que l'adresse IP a été réalisée avec succès. les niveaux de protéine étiquetée FLAG doivent également être vérifiés avant l'analyse …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807 (2010).
- Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
- MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
- Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
- Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
- Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
- Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
- Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430 (2013).
- ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics – the user’s guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
- Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
- Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
- Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
- Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
- Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D’Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
- Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).
