このプロトコルは、成人および高齢者の骨格筋からの単離および筋芽細胞の前駆細胞の培養の、堅牢で再現性と簡単な方法について説明します。ここで使用される筋肉は足と脚の筋肉を含みます。このアプローチは、機能的研究のための一次筋芽細胞の濃縮集団の単離を可能にします。
骨格筋の恒常性は、筋肉の成長(肥大)、萎縮と再生に依存します。老化の間、およびいくつかの疾患で、筋肉の消耗が発生します。筋肉量及び機能の喪失は、筋線維型萎縮、繊維型スイッチング、衛星細胞、筋肉幹細胞、および他の病態生理学的プロセスの機能不全に関連する欠陥筋再生に関連付けられています。これらの変化は、細胞内の変化だけでなく、局所的および全身のニッチと関連しています。倫理的な意味に筋肉の老化の最も一般的に使用されるげっ歯類モデルに加えて、筋肉のホメオスタシスおよびヒトモデルを使用して無駄を検討する必要があり、これは、主としてインビトロ培養物から成ります。人間の筋原性前駆細胞(MPCは)および筋形成における一次筋芽細胞の広範な使用にもかかわらず、加齢に関連したMUSの異なる側面を制御する分子メカニズムを研究するために、ヒト初代筋芽細胞および筋管培養を用いて上の限られたデータがあります老化のメカニズムの検証を助けるCLE消耗は、齧歯類の筋肉で提案されています。成人および高齢者から単離されたヒトのMPC、一次筋芽細胞および筋管の使用は、筋肉の成長、萎縮および再生に関連するプロセスの分子機構の生理学的に関連するモデルを提供します。ここでは詳細に人間のMPCとその子孫の単離および維持のため、堅牢で安価で、再現性と効率的なプロトコルを記述 – 酵素消化を用いて、ヒトの筋肉サンプルから筋芽細胞および筋管。さらに、我々は、成人および高齢者からの一次筋芽細胞は、 インビトロ培養で老化を起こすれる通過数を決定しました。最後に、我々はこれらの筋芽細胞およびそれらの増殖および分化能力を特徴付け、筋形成し、in vitroでの筋萎縮の分子機構の機能研究を行うための適性を提案する能力をトランスフェクトする能力を示します。 </p>
疾病や虚弱で、骨格筋量および機能結果の年齢に関連した進行性の喪失、高齢者の生活の質の強度及び減少の減少。骨格筋は、約40%の体重1を占めます。脂肪及び線維症の浸潤に、個々の筋線維と筋品質の低下の進行性萎縮老化および疾患中1、2、3、4、5、6を生じます。 最近では、特にげっ歯類で発生すること筋繊維損失は、人間7で発生しないことがあり、骨格筋の老化における種特異的な違いが発生することが提案されています。それにもかかわらず、高齢者の哺乳動物の残りの筋繊維が損傷し、障害のある再生に感受性の増加によって特徴づけられます<supクラス= "外部参照"> 8。 大人の筋肉の修復とメンテナンスが衛星細胞9、10によって媒介されます。筋損傷およびその他の関連する手がかりすると、衛星細胞が活性化し、増殖になります。細胞のサブセットは、静止状態に戻り、残りは筋芽細胞(筋原性前駆細胞 – のMPC)に進行します。これらは、既存の筋線維11の修復に貢献します。衛星細胞の機能は、筋肉再生の成功を決定し、加齢に伴う衛星細胞の利用可能性の変化は12、13、14、15に示されています。また、古いヒトおよび齧歯類の筋肉からの衛星細胞は、転写プロファイルスイッチを示し、再生能16,17を 低減 </sup> 18、19。老齢マウスおよびヒトの筋肉衛星細胞は、それらの還元機能20をもたらす老化を受けることが示されています。
筋恒常性の研究を可能にする最も確立された細胞株は、マウスC2C12細胞ライン21です。研究のかなりの量はまた、マウスの一次筋芽細胞22を使用しています。これらの培養物は、マウスと脊椎動物の筋形成だけでなく、筋肉再生、筋管/筋線維の萎縮、および筋肉疾患の間に発生し、23、24、25、26を老化肥大プロセスの重要な理解につながっています。さらに最近では、いくつかのグループが筋形成と筋肉の老化を研究するためにヒト一次筋芽細胞を用いて説明しています。しかし、レガールとのコンセンサスが欠如しています成人および高齢のヒト27、28、29、30、31の筋肉から単離された一次筋芽細胞との間の差にDS。全身および局所環境は、老化や病気6、32、33、34、開発中に発生する特徴の違いにもかかわらず、in vitroでの筋芽細胞および筋管培養物は、筋肉の発達、成長および萎縮に関連する分子メカニズムを研究するための最もアクセスしやすいツールが残ります。さらに、これらの研究だけでなく、堅牢を提供するだけでなく、 インビトロツールは比較的、迅速、安価で高スループット。さらに、ヒトの筋肉の研究に関連した倫理的含意が機能的実験のために、遺伝子発現の操作を伴うことを意味します<em>、in vitroでのヒト筋芽細胞および筋管培養物は、脊椎動物のモデル生物が利用可能な唯一の代替残ります。
ここでは、成人および高齢者の筋肉からの一次筋芽細胞、またはのMPCの、堅牢で安価、かつ再現性の分離のための簡単な実験プロトコルを、示し、in vitro培養( 図1)の標準化された条件を説明します。筋肉からの初代培養物は、通常、筋芽細胞に加えて、線維芽細胞が含まれているように、我々は、一次筋芽細胞の純度が向上し、品質を目指しプレプレーティングステップをお勧めします。要約すると、我々は、効率的かつ再現性の分離、文化、大人や高齢者の骨格筋からの富化および機能のMPC /一次筋芽細胞の機能研究を可能にするプロトコルを確立しました。
ここでは、伸筋digitorium・ブレビス、前脛骨筋または外転halluces筋肉から成人および高齢のヒトから筋前駆細胞/一次筋芽細胞を単離する、シンプルな堅牢、安価で、再現性と効率的な方法を提示します。このプロトコルは、FACS-またはMACSソーティングなど、より洗練された方法は、実用可能かどうかではない場合は特に、成人および高齢のヒトからヒト一次筋芽細胞を用いた研究を可能にすることを目指しています。
この原稿で提示分離法は、約2時間かかります。筋肉の分離の間、筋肉は、汚染を避けるために70%エタノールで洗浄しました。筋肉の解離を酵素的に先立って、小さいが、可視片に筋肉を切断し、あまりにも多くのミンチからの細胞の損傷を避けることが重要です。筋線維の解離および衛星細胞および筋原性前駆細胞のリリースで消化結果。骨格筋の〜20ミリグラム、1 60ミリメートルのための私達の場合には(20 cm 2)をペトリ皿に細胞を回収するための最も適切な表面積でした。小さい表面上に播種した細胞は、細胞死の増加および凝集を示したのに対し、より大きな表面上に播種した細胞は、増殖が減少を示しました。
分離の際に、細胞を培養し、ラミニン被覆されたプレート上で増殖させました。非被覆表面を使用することは、分離の成功を減少させる傾向がありました。この理由のために、細胞は、好ましくは直接分離した後、予めコーティングされた表面上に収穫することができます。細胞を直接単離後、非被覆表面に収穫された場合の線維芽細胞富化培養物は、筋芽細胞由来の細胞ではなく、優勢になります。別にラミニンから、例えばマトリゲルおよびコラーゲンベースの試薬のような他の細胞接着溶液の使用を使用することができます。コーティング溶液は、細胞増殖を促進する成長因子および他の化合物を挙げることができるが、これらは、細胞の挙動、したがって、実験結果を変化させることができます。にそれは、任意の成長因子または他の相補体を欠いているように私たちの経験、を10μg/ mLのラミニンは、衛星細胞および筋芽細胞の付着および増殖のための最適な濃度および適切なコーティング試薬です。また、ラミニンは、直接骨格筋線維を介して衛星細胞の付着および遊走に重要な機能を果たしている筋細胞膜に結合された、基底膜中に天然に存在しています。
培養培地のサプリメントは、一次筋芽細胞の挙動に有害な影響を与える可能性があります。このようなのFGFまたはIGF類として、例えば成長因子群については、FGF-2は、分裂促進およびプログラム細胞死応答31の両方を制御することで、一次筋芽細胞培養物に対する多面的効果を有します。大人と高齢者の筋肉から単離した初代筋芽細胞の挙動の違いが原因で純度Oになる可能性が非常に高い、特にので、厳密に培養条件を制御することが必要です文化や長期培養35時の培養液中の筋芽細胞をオーバーラン線維芽細胞の可能性F。私たちは、線維芽細胞と培養液の汚染を低減するために、非コーティングされた表面上に第1分離の間に細胞の1時間前メッキを使用しています。
私たちが説明する方法は、成人および高齢者ヒトの両方の筋肉から筋原性前駆細胞を単離するための適切です。筋原細胞の高い割合によって示される( 図1においてMF20免疫染色によって可視化のMyoD発現および筋形成特性および2)およびプロセスの機能的研究のためのin vitroモデルとして使用することができる単離された細胞は、細胞の代表的な筋原集団で構成され筋肉の恒常性に関連付けられています。
これまでの研究では、ヒト一次筋芽細胞の単離および特性の違い、またはその欠如、からを特徴としています成人および高齢者6、20、27、28、29、30、31、35、3 6、37、38。高齢者および/または非機能的なヒトのMPCの存在は、6、20、22に示されています。しかし、新たに単離されたヒトのMPCの挙動の差も27が示されていません。私たちのプロトコルは、高齢者の筋肉から単離した初代筋芽細胞の減少増殖能や老化などに少なくとも部分的にそれらの表現型を維持し、一次筋芽細胞の単離を可能にし、これらを使用することが可能になります22を老化時の筋肉の恒常性の分子機構の機能研究のための細胞。
ここに記載した方法を用いて単離された初代筋芽細胞は、筋原性分化研究のためのみならず、使用することができるだけでなく、老化の間のヒト筋原性前駆細胞に存在する遺伝子発現の変化のような細胞内の変化を調査します。しかし、長期のex vivoで培養中の細胞に生じる変化は、老化の間に生じる表現型と遺伝子型の変化を分析する際に考慮される必要があります。私たちは、この目的のために新たに単離した細胞を使用することをお勧めします。
また、ここで説明した一次筋芽細胞培養法は、堅牢なin vitroでの機能研究を可能にし、拡張およびヒト一次筋芽細胞の比較的長期培養を可能にします。我々は、以前に我々の方法を用いて単離した筋原性前駆細胞が発現プロファイリングおよびFUの両方に使用することができることを示しています筋肉の老化22に関連するプロセスのnctional研究。この方法はまた、成体の筋肉や古いげっ歯類に適用可能であり、高齢化と機能研究22の間に遺伝的およびエピジェネティックな変化をプロファイリングするために使用することができる筋芽細胞の濃縮された文化を単離することができます。この方法の制限は、細胞のある程度、混合集団ではなく、より洗練された公開された方法6、28、29、39、40、41、42を用いて得ることができる衛星細胞の純粋な集団の使用を含みます43。
私たちは、大人と高齢者からの一次筋芽細胞の細胞の単離のために、簡略化された手頃な価格で、かつ再現性のあるプロトコルを提示します人間。我々の経験では、(そのようなMACS-またはFACSソート衛星細胞など)ヒト一次筋芽細胞の単離および文化の利用可能な、より洗練された方法は、細胞中のトランスクリプトームやプロテオーム変化をプロファイリングなどの研究、いくつかの種類に最適です。しかし、これらの方法は、高価であり、専門知識の少なくともいくつかのレベルを必要とし、かつによる筋芽細胞を過剰成長純粋な一次筋芽細胞培養および線維芽細胞の低増殖率に難しいかもしれません。
私たちは、機能的研究で使用するためのヒト一次筋芽細胞の簡単な単離および培養を可能に再現可能なプロトコルを提示します。さらに、当社は、ラミニン42の使用と成功の文化44のための鍵となる要因としてbFGFの限られた使用を提案しています。我々はまた、細胞を分割し、第一通路45に1つのプレめっき工程時に遠心分離することにより発生する応力を回避することを提案します。要約すると、我々が持っていますまた、げっ歯類の筋肉に適用可能であり、表情や筋肉の恒常性の機能研究を可能にし、成人と高齢者のヒトの筋肉からの一次筋芽細胞/のMPCの単離および培養のための効率的なプロトコルを最適化しました。
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/L021668/1), the MRC and Arthritis Research UK as part of the MRC – Arthritis Research UK Centre for Integrated Research into Musculoskeletal Ageing (CIMA) and the Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (097826/Z/11/A). The authors would like to thank Dr Dada Pisconti (University of Liverpool) for her expertise and advice in the isolation of muscle progenitor cells.
60mm Petri dishes | Greiner Bio One | 628160 | Cellstar Cell culture dish, PS, 60/15 MM, VENTS. |
Cell culture plates (6 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3516 | Corning Costar cell culture plates. 6 well, flat bottom (Individually wrapped) . |
Cell culture plates (12 wells) | Greiner bio-one | 657 160 | Cellstar Cell culture Multiwell Plates. |
Culture flasks | Greiner Bio One | 690175 (25cm2); 658175 (75cm2). | Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks. |
Standard Disposable Scalpel | Granton | 91310 | Sterile stainless steel blade, pattern: 10. |
Pipettes | Greiner bio-one | 606 180 (5 ml); 607 180 (10 ml); 760 180 (25 ml) | Cellstar Serological Pipettes. |
Pasteur plastic pipettes | Starlab | E1414-0311 | 3.0ml Graduated Pasteur Pipette (Sterile), Ind. Wrapped. |
Syringe | BD | 300613 | 20 mL BD eccentric tip syringe. |
0.2 µm filters | Gilson | ALG422A | Sterile Syringe Filters CA 0.2um 33mm Pk50. |
Cell strainers | Fisher Scientific | 11597522 | Cell culture strainer sterile individually packed 70µm polypropylene. |
Collagenase D | Roche | 11088882001 | Collagenase D; ctivity: >0.15 U/mg |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | Dispase II Protease from Bacillus polymyx. Activity: ≥0.5 units/mg solid. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | Calcium chloride, anhydrous, beads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane. 1mg/mL. |
DMEM-high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose. With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine and sodium pyruvate. |
F-12 media | Gibco | 21765029 | Ham's F-12 Nutrient Mix. 1x + L-glutamine. |
FGF-b | PetroTech | 100-18B | Recombinant Human Fibroblast Growth Factor-basic. |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Fetal Bovine Serum. |
Horse serum (HS) | Sigma-Aldrich | H1270 | Horse Serum. Donor herd, USA origin, sterile-filtered. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Penicillin-Streptomycin with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, sterile-filtered. |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | L-Glutamine solution. 200 mM, solution, sterile-filtered. |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | Trypsin-EDTA solution. 0.25%, sterile-filtered. |
TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red. |
DPBS (cell culture) | Sigma-Aldrich | D8537 | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline. Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. |
PBS (immunostaining) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Phosphate buffered saline tablet. One tablet per 200 mL of deionized water (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4). |
Methanol | Fisher | M/4000/PC17 | Methanol Analytical Reagent Grade |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 for molecular biology. |
anti-MF 20 antibody | DSHB | MF20-c 2ea 211 µg/ml. | MYH1E (MF 20) Mouse mAb. |
anti-MyoD antibody | Cell Signaling Technology | 13812P | MyoD1 (D8G3) XP Rabbit mAb. |
anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | Rabbit mAb to Ki67 [SP6]. |
Anti-mouse 488 secondary antibody | Invitrogen | A-11029 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
Anti-rabbit 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate. |
DAPI | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) |
Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | Senescence β-Galactosidase Staining kit. |
DMSO | Sigma-Aldrich | 41639 | Dimethyl sulfoxide. BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC). |
Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A8097 | Acridine Orange hydrochloride solution, 10 mg/mL in H2O. |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Ethidium bromide solution. BioReagent, for molecular biology, 10 mg/mL in H2O. |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Lipofectamine 2000 Transfection Reagent |
Scramble control for transfections | Qiagen | 1027271 | miScript Inhibitor Neg. Control (5 nmol) |
Hsa-miR-378a-3p miScript Primer Assay | Qiagen | 218300 | Hs_miR-422b_1 miScript Primer Assay (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor | Qiagen | 219300 | Anti-hsa-miR-378a-3p miScript miRNA Inhibitor (targets mature miRNA: hsa-miR-378a-3p). MIMAT0000732: 5'ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC |
Megafuge 2.0 R Centrifuge | Heraeus | 75003085 | n/a |
Centrifuge rotor | Heraeus | 3360 | Heraeus Sepatech Megafuge Centrifuge Rotor BS4402/A. Max. radius: 15.5 cm. |
Eclipse Ti-E Inverted Microscope System | Nikon | n/a | Eyepieces: CFI 10x/22; Total magnification: 100x (MF20, Live/dead and Ki67). |
Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: Carl Zeiss 1016-758 W-PI 10x/25; Total magnification: 100x (Senescence β-Galactosidase Staining). |
Axiovert 25 inverted microscope | Carl Zeiss | n/a | Eyepieces: E-PL 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Diaphot Inverted Tissue Culture Microscope | Nikon | n/a | Eyepiece: CFWN 10x/20. Total magnification: 100x (bright field). |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | Hydromount |