मानव endocervical गामा डेल्टा टी कोशिकाओं के अलगाव और प्रवाह cytometric विश्लेषण
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
महिला प्रजनन पथ (FRT) श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रणाली रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करता है। जननांग म्यूकोसा का बेहतर ज्ञान इसलिए एचआईवी सहित विभिन्न रोगाणुओं की pathogenicity को समझने के लिए आवश्यक है। गामा डेल्टा (जीडी) टी कोशिकाओं 'अपरंपरागत' टी कोशिकाओं के प्रोटोटाइप कर रहे हैं और टी कोशिकाओं heterodimeric टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) गामा और डेल्टा जंजीरों की रचना की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित की एक अपेक्षाकृत छोटे सबसेट प्रतिनिधित्व करते हैं। इससे उन्हें शास्त्रीय और ज्यादा बेहतर जाना जाता सीडी 4+ टी कोशिकाओं सहायक और सीडी 8 + साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं है कि अल्फा बीटा TCRs द्वारा परिभाषित कर रहे हैं से अलग करता है। जीडी टी कोशिकाओं अक्सर ऊतक विशेष स्थानीयकरण दिखाने के लिए और उपकला में समृद्ध कर रहे हैं। जीडी टी कोशिकाओं में सूजन, ट्यूमर निगरानी, संक्रामक रोग, और autoimmunity में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आर्केस्ट्रा।
यहाँ, हम एक विधि reproducibly अलग और मानव endocervical अंतःउपकला जीडी टी lymphocytes विश्लेषण करने के लिए उपस्थित थे। हम हामहिलाओं की Interagency एचआईवी संक्रमण अध्ययन (WIHS) में भाग लेने के लिए महिलाओं से endocervical cytobrush नमूनों का इस्तेमाल किया है। शर्तों के दौरान जीडी टी कोशिकाओं बातचीत के बारे में ज्ञान जिसमें वहाँ योनि श्लैष्मिक का अपमान है योनि microbicides.In अलावा के विकास सहित, किसी भी नैदानिक अध्ययन में श्लैष्मिक असुरक्षा संबोधित किया है करने के लिए लागू किया जा सकता है, श्लैष्मिक जीडी टी सेल प्रतिक्रिया के बारे में ज्ञान है संक्रामक रोगों के उपचार में जीडी टी सेल आधारित चिकित्सा प्रतिरक्षा के आवेदन के लिए संभावित।
Introduction
हम अंतःउपकला जीडी टी कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के endocervical ब्रश नमूने का उपयोग करने की पद्धति विकसित की। endocervical नहर स्तंभ उपकला की एक परत से तैयार है। अंतःउपकला लिम्फोसाइट उपकला परत के भीतर रहने वाले सीमावर्ती लिम्फोसाइट है कि तेजी से रोगजनक रोगाणुओं का सामना 7, 8 पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आरंभ कर सकते हैं प्रतिनिधित्व करते हैं। endocervical अंतःउपकला डिब्बे की रोग प्रतिरोधक घटनाओं को समझने प्रभावी रणनीति के डिजाइन एचआईवी सहित संक्रमण, को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
हमारे विधि आगे एचआईवी संक्रमण के साथ या एचआईवी संक्रमण के जोखिम में महिलाओं में अंतःउपकला जीडी टी कोशिकाओं की भूमिका का पता लगाने के लिए हौसले से एकत्र मानव endocervical नमूने के रूप में अच्छी तरह से जमे हुए endocervical कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य endocervical अंतःउपकला डिब्बे में उपन्यास प्रतिरक्षात्मक घटनाओं को खोजने के लिए और evaluat करने के लिए हैएचआईवी संक्रमण के साथ महिलाओं में असुरक्षा की श्लैष्मिक एक मार्कर के रूप में ई जीडी टी सेल प्रतिक्रिया।
FGT प्रतिरक्षा के आसपास ज्ञान में काफी अंतराल आंशिक रूप से सफलतापूर्वक इकट्ठा करने और श्लैष्मिक नमूने प्रसंस्करण में कठिनाई के कारण हैं। इसके अलावा, श्लैष्मिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के जटिल विविधता, और एक दूसरे के साथ उनके interconnectedness, चिकित्सकीय प्रासंगिक माप है कि राज्य और प्रतिरक्षा प्रणाली की क्षमता को प्रतिबिंबित करने के लिए की पहचान के प्रमुख चुनौतियां हैं। हम उच्च शुद्ध अंतःउपकला जीडी टी कोशिकाओं है कि आगे हो सकता है अत्यधिक मल्टिप्लेक्स, एकल कोशिका प्रौद्योगिकियों कि FRT उन्मुक्ति के अंतर्निहित तंत्र की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है का उपयोग विश्लेषण प्राप्त करने के लिए एक विधि विकसित की है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मादा जननांग पथ कम श्लैष्मिक असुरक्षा का आकलन एचआईवी अधिग्रहण और संचरण के जोखिम को संबोधित नैदानिक अध्ययन का एक आवश्यक घटक है। आमतौर पर एचआईवी संक्रमण के जोखिम को FGT जननांग स्राव (साइटोकिन्स, chemokines और र…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस काम में भाग लेने के लिए अपनी इच्छा के लिए मियामी WIHS अध्ययन प्रतिभागियों को धन्यवाद। इस पांडुलिपि में डेटा मियामी महिलाओं की एचआईवी Interagency अध्ययन (WIHS) द्वारा एकत्र किए गए थे। इस प्रकाशन की सामग्री को केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करते। इस काम में आगे बढ़ने के लिए एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान और महिला Interagency एचआईवी संक्रमण अध्ययन (WIHS) [अनुदान संख्या U01 AI103397], नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोगों, स्वास्थ्य [अनुदान संख्या P30AI073961] के राष्ट्रीय संस्थानों, राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा समर्थित किया गया ट्रांसलेशनल विज्ञान और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ अल्पसंख्यक स्वास्थ्य और स्वास्थ्य असमानताओं पर, स्वास्थ्य [अनुदान संख्या UL1TR000460 और 1KL2TR000461] के राष्ट्रीय संस्थान, एवं बाल स्वास्थ्य और मानव विकास, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान [अनुदान संख्या K23HD074489]।
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
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