Isolamento e Citometria de Fluxo Analysis of Human Endocervical Gama Cells Delta T
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
O trato reprodutivo (FRT) da mucosa sistema imunológico feminino serve como a primeira linha de defesa. Melhor conhecimento da mucosa genital é, portanto, essencial para a compreensão da patogenicidade de diferentes patógenos, incluindo o HIV. Gama células delta (GD) T são o protótipo de células T 'não convencionais' e representam um subconjunto relativamente pequeno de células T definidos pela sua expressão de receptores de células T heterodiméricos (TCRs) compostas de cadeias gama e delta. Isso os diferencia das células T clássicos e muito melhor conhecidos CD4 + auxiliares e células CD8 + T citotóxicos que são definidos por TCRs alfa-beta. GD células T muitas vezes mostram a localização específica do tecido e são enriquecidos em epitélio. GD células T orquestrar respostas imunes em inflamação, vigilância de tumores, doenças infecciosas e auto-imunidade.
Aqui, apresentamos um método para isolar reprodutível e analisar linfócitos intra-epiteliais endocervicais humanos GD T. que have amostras cytobrush endocervicais usados mulheres participantes Infecção Estudo Interagency HIV das Mulheres (WIHS). Conhecimento sobre GD células T interações durante as condições em que não é um insulto à mucosa vaginal poderia ser aplicada a qualquer estudo clínico em que a vulnerabilidade das mucosas são os destinatários, incluindo o desenvolvimento de adição microbicides.In vaginal, o conhecimento sobre as respostas das células da mucosa GD T tem potencial para aplicação de terapia imunitária baseada em células T GD no tratamento de doenças infecciosas.
Introduction
Nós desenvolvemos metodologia de utilização de amostras escova endocervical para avaliar células GD T intra-epitelial. O canal endocervical é recoberto por uma camada única de epitélio colunar. Linfócitos intra-epiteliais representam linfócitos linha de frente que residem na camada epitelial que podem iniciar rapidamente as respostas imunes ao encontrar micróbios patogênicos 7, 8. Compreender os eventos imunológicos do compartimento intra-epitelial endocervical é importante para a concepção de estratégias eficazes para prevenir infecções, incluindo o HIV.
O nosso método pode ser aplicado a amostras endocervicais humanos recentemente recolhidos, bem como células endocervicais congelados para explorar ainda mais o papel das células T intra-epiteliais GD em mulheres com infecção por VIH ou em risco de infecção pelo HIV. O principal objectivo deste protocolo é descobrir novos eventos imunológicos no compartimento intra-epitelial endocervical e Avaliado comrespostas de células e GD T como um marcador de vulnerabilidade da mucosa em mulheres com infecção pelo HIV.
As lacunas substanciais no conhecimento em torno imunidade FGT são parcialmente devido à dificuldade na recolha e processamento de amostras de mucosa com sucesso. Além disso, o complexo de heterogeneidade das células imunes das mucosas, e a sua interligação uns com os outros, são os principais desafios para a identificação de medições clinicamente relevantes que reflectem o estado e a capacidade do sistema imunitário. Nós desenvolvemos um método para obter células T GD intra-epitelial altamente purificados que podem ser analisados usando tecnologias altamente multiplexados, de uma única célula que pode ser fundamental para identificar os mecanismos subjacentes da imunidade FRT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avaliação da vulnerabilidade das mucosas do tracto genital inferior feminino é um componente essencial de estudos clínicos que abordam risco de aquisição e transmissão do HIV. Tipicamente FGT vulnerabilidade à infecção do HIV é avaliada através da medição moduladores imunitários solúveis em secreções genitais (citocinas, quimiocinas e péptidos antimicrobianos) 12, 13. No entanto, estes biomarcadores são apenas indicativos da inflamação vagi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos participantes do estudo Miami WIHS para a sua vontade de participar neste trabalho. Os dados apresentados nesta manuscrito foram recolhidos por Interagency HIV Study das Mulheres Miami (WIHS). O conteúdo desta publicação é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam a posição oficial do National Institutes of Health (NIH). Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e das mulheres Infecção Estudo Interagency HIV (WIHS) [subvenção número U01 AI103397], Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, Instituto Nacional de Saúde [número de concessão P30AI073961], Centro Nacional para a Promoção Ciências translacionais e do Instituto Nacional sobre Minority Saúde e Saúde disparidades, Instituto Nacional de Saúde [número de concessão UL1TR000460 e 1KL2TR000461], e do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, Instituto Nacional de Saúde [número de concessão K23HD074489].
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
