In vivo Investigation of Antimicrobial Therapy Blue Light pour multirésistante Acinetobacter baumannii Gravez Infections En utilisant l' imagerie par bioluminescence
Summary
Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.
Abstract
Brûler les infections continuent d'être une cause importante de morbidité et de mortalité. L'émergence croissante des bactéries multirésistantes (MDR) a conduit à l'échec fréquent des traitements antibiotiques traditionnels. D'autres sont thérapeutiques d'urgence nécessaires pour lutter contre les bactéries MDR.
Une approche innovante non-antibiotique, bleu clair antimicrobien (ABL), a montré l'efficacité prometteuse contre les infections MDR. Le mécanisme d'action de ABL est pas encore bien compris. Il est généralement supposé que sont excités par ABL, qui à son tour se produisant naturellement chromophores photosensibilisants endogènes dans des bactéries (par exemple, les porphyrines libres de fer, les flavines, etc.) produit des espèces oxygénées réactives cytotoxiques (ROS) par l' intermédiaire d' un processus photochimique.
Contrairement à une autre approche antimicrobienne à base de lumière, la thérapie photodynamique antimicrobien (aPDT), la thérapie ABL ne nécessite pas l'intervention d'un photosensitiz exogèneer. Tout ce qu'il a besoin de prendre effet est l'irradiation de la lumière bleue; , Il est donc simple et peu coûteuse. Les récepteurs ABL sont les photosensibilisants endogènes cellulaires chez les bactéries, plutôt que de l'ADN. Ainsi, Abl est considérée comme beaucoup moins génotoxique à des cellules hôtes que ultraviolets C (UVC) irradiation, ce qui provoque directement des dommages de l'ADN dans des cellules hôtes.
Dans cet article, nous présentons un protocole pour évaluer l'efficacité du traitement ABL pour MDR Acinetobacter baumannii infections dans un modèle de souris de brûlure. En utilisant une souche bioluminescente d'ingénierie, nous avons pu surveiller de manière non invasive l'étendue de l'infection en temps réel chez les animaux vivants. Cette technique est également un outil efficace pour la surveillance de la distribution spatiale des infections chez les animaux.
Introduction
Brûler les infections, qui sont fréquemment signalées en raison de blessures thermiques cutanées, continuent d'être une cause importante de morbidité et de mortalité 1. La prise en charge des infections de brûlures a été compromise par l'autre émergence croissante de souches bactériennes résistantes (MDR) 2 en raison de l'utilisation massive d'antibiotiques. Important MDR bactéries Gram-négatives est Acinetobacter baumannii, qui est connu pour être associé à des blessures de combat récentes et résiste à presque tous les antibiotiques disponibles 3. La présence de biofilms dans les foyers blessé a été rapporté 4, 5 et on pense à exacerber la tolérance aux antibiotiques et à la défense de l' hôte 6, 7, ce qui provoque des infections persistantes 8, 9. Par conséquent, il y a un outig besoin pour le développement de traitements alternatifs. Dans la Stratégie nationale de lutte contre les bactéries résistantes aux antibiotiques, le développement de thérapies alternatives aux antibiotiques récemment annoncé a été noté comme une action par le gouvernement des États-Unis 10.
approches antimicrobiens à base de lumière, comme il est indiqué par le nom, nécessitent une irradiation lumineuse avec ou sans autres agents. Ces approches comprennent la thérapie photodynamique antimicrobienne (aPDT), aux ultraviolets C (UVC) irradiation, et la lumière bleue antimicrobien (ABL). Dans des études antérieures, ils ont montré l' efficacité prometteuse pour tuer des souches MDR bactériennes 11, 12, 13. Parmi les trois approches à base de lumière, ABL a attiré une attention croissante au cours des dernières années en raison de ses propriétés antibactériennes intrinsèques sans l'utilisation de photosensibilisants 14. en comparison à aPDT, ABL implique que l'utilisation de la lumière, alors que aPDT nécessite une combinaison de lumière et un photosensibilisant. Par conséquent, ABL est 14 simple et peu coûteux. Par rapport à UVC, ABL semble être beaucoup moins cytotoxique et génotoxique pour les cellules hôtes 15.
L'objectif de ce protocole est d'étudier l'efficacité de ABL pour le traitement des infections causées par des brûlures MDR A. baumannii dans un modèle de souris. Nous utilisons des bactéries pathogènes bioluminescentes pour développer de nouveaux modèles de souris d'infections de brûlures qui permettent la surveillance non invasive de la charge bactérienne en temps réel. Par rapport à la méthode traditionnelle de prélèvement de fluide corporel / tissulaire et le placage subséquent et une colonie de comptage 16, cette technique fournit des résultats précis. Le processus de prélèvement de tissu pourrait introduire une autre source de l'erreur expérimentale. Comme l'intensité de luminescence bactérienne est linéairement proportionnelle aux corresponding CFU 17 bactérienne, on peut mesurer directement la survie des bactéries après une certaine dose d'irradiation de lumière. En surveillant la charge bactérienne chez les animaux vivants recevant le traitement par la lumière en temps réel, la cinétique de la destruction des bactéries peuvent être caractérisés par un nombre significativement réduit de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abl est un nouveau procédé pour traiter les infections. Depuis son mécanisme d'action est complètement différent de celui de la chimiothérapie, il est plus d'une physiothérapie. L'agent qui médie l'effet antimicrobien est l'irradiation de la lumière bleue (400-470 nm). Avec le développement de LED bleues, nous avons eu accès à une approche antimicrobienne à base de lumière simple et efficace pour les infections MDR.
Dans ce protocole, nous avons décrit le d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Center for Integration of Medicine and Innovative Technology (CIMIT) under the U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Cooperative Agreement (CIMIT No. 14-1894 to TD) and the National Institutes of Health (1R21AI109172 to TD). YW was supported by an ASLMS Student Research Grant (BS.S02.15). We are grateful to Tayyaba Hasan, PhD at the Wellman Center for her co-mentorship for YW.
Materials
| IVIS | PerkinElmer Inc, Waltham, MA | IVIS Lumina Series III | Pre-clinical in vivo imaging |
| Light-emitting diode LED | VieLight Inc, Toronto, Canada | 415 nm | Light source for illumination |
| Power/energy meter | Thorlabs, Inc., Newton, NJ | PM100D | Light irradiance detector |
| Mouse | Charles River Laboratories, Wilmington, MA | BALB/c | 7-8 weeks age, 17-19 g weight |
| Acinetobacter baumannii | Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TX | Clinical isolate | Engineered luminescent strain |
| Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 721016 | 0.9% Sodium Chloride |
| Phosphate Buffered Saline, 1X Solution | Fisher Scientific | BP24384 | A standard phosphate buffer used in many biomolecular procedures |
| Brain Heart Infusion | Fisher Scientific | B11059 | Bacterial culture medium |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | For bacterial suspension centrifuge |
| Benchtop Incubated Orbital Shakers | Laboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH | Incu-Shaker Mini | For culturing of bacteria |
| Inoculating Loops | Fisher Scientific | 22-363-605 | For smearing bacterial inoclum on burn surface of mice |
| Fisher Scientific Redi-Tip Pipet Tips, 1-200µL | Fisher Scientific | 02-707-502 | Pipet Tips |
| Thermo Scientific Sorvall Legend X1 Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-220 | For bacterial suspension seperation |
| Brass Block | Small Parts, Inc., Miami, FL | 10 mm by 10 mm | For creation of burns in mice |
| Extreme Dragon PBI/Kevlar High-Heat Gloves | Superior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NY | PBI83514 | Heat Resistant Gloves |
| Greiner dishes | Sigma-Aldrich Co. LLC | P5112-740EA | 35 mm ×10 mm |
| Corning Digital Hot Plate | Cole-Parmer Instrument Company, LLC | UX-84301-65 | 10" x 10", 220 VAC, for boiling water |
| Mouse/Rat Thin Line Water Heated Surgical Bed | E-Z Systems | EZ-211 | Prevents heat loss and hypothermia during surgery |
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