Vasodilatation induite par l’insuline régule la perfusion musculaire et augmente la microvasculaire surface habitable (recrutement microvasculaire) disponible pour échange soluté entre interstitium de sang et de tissus. La microscopie intravitale combinée et échographie de contraste accentué est présenté Evaluer simultanément l’action de l’insuline à des gros vaisseaux et la microcirculation in vivo.
Il a été démontré que les actions vasculaires de l’insuline contribuent à régulation de sensibilité à l’insuline. Effets de l’insuline sur la perfusion du muscle réglementent postprandiale livraison des hormones et des nutriments aux tissus sensibles à l’insuline. Nous décrivons ici une technique permettant de combiner la microscopie intravitale (IVM) et l’échographie de contraste accentué (UFC) du compartiment de l’adducteur de la souris du membre postérieur de visualiser simultanément les artères de résistance musculaire et de la perfusion de la microcirculation in vivo. En même temps évaluer les effets de l’insuline à de multiples niveaux de l’arbre vasculaire est important pour étudier les relations entre les multiples effets vasoactifs de l’insuline et la perfusion du muscle. Expériences dans cette étude ont été effectuées chez la souris. Tout d’abord, la canule de veine de queue est insérée pour l’infusion d’anesthésie, composés vasoactifs et agent de contraste ultrasonore (microbulles encapsulé lipidique). Deuxièmement, une petite incision est pratiquée dans la région de l’aine pour exposer l’arbre artériel du compartiment muscle adducteur. La sonde est ensuite positionnée sur le postérieur supérieur controlatéral pour visualiser les muscles en coupe transversale. Pour évaluer les paramètres de ligne de base, le diamètre artériel est évalué et microbulles sont infusés par la suite à un rythme constant pour estimer le débit sanguin musculaire et volume sanguin microvasculaire (MBV). Lorsqu’il est appliqué avant et Pendant un clamp euglycémique hyperinsulinique, combiné IVM et UFC permettre l’évaluation de changements induite par l’insuline du diamètre artériel, perfusion musculaire microvasculaire et sensibilité à l’insuline de l’organisme entier. En outre, la relation temporelle entre les réponses de la microcirculation et les artères de résistance à l’insuline peut être quantifiée. Il est également possible de suivi la souris longitudinalement dans le temps, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les changements dans la sensibilité à l’insuline vasculaire et confiné.
En réponse à une augmentation de la glycémie, le pancréas sécrète de l’insuline dans le sang où il est rapidement distribué à ses tissus cibles tels que les muscles squelettiques, via les artères de résistance et les capillaires. Le muscle squelettique est responsable d’environ 80 % de l’absorption de glucose postprandial1. L’injection d’insuline à l’interstitium de muscle squelettique s’est avérée être un taux limitant l’étape pour les actions métaboliques d’insuline qui favorisent l’élimination de glucose pour2,3,4. Moins de 10-15 min, l’insuline augmente le volume de sang capillaire (microvasculaire recrutement), un effet qui se produit avant que le débit sanguin total augmente de5,6. Microvasculaire recrutement élargit la surface endothéliale disponible pour échange de nutriments (et insuline)7,8. Induite par l’insuline microvasculaire recrutement précède et est indépendamment associée à des changements dans le muscle squelettique glucose uptake8,9. L’effet de l’insuline sur le système vasculaire a été appelé « sensibilité à l’insuline vasculaire ».
Il a été démontré que le recrutement microvasculaire induite par l’insuline et la vasodilatation induite par l’insuline sont altérées chez les obèses Zucker rats10,11. En outre, des souris maigres avec diminution de la densité capillaire affichent muscle insulino résistance12. Dans leur ouvrage influent, Kubota et coll. ont montré que l’insuline avec facultés affaiblies, la signalisation dans les cellules endothéliales entraîné une baisse recrutement microvasculaire induite par l’insuline, ce qui réduit l’absorption du glucose dans le muscle squelettique par environ 40 %13. Ces anomalies microvasculaires fonction ne seulement produisent pas dans le muscle, mais aussi dans plusieurs autres tissus et les organes comme le cœur, rétine et rein14,15,16. Ces exemples et autres études17,18,19,20 suggèrent que les effets vasculaires de l’insuline constituent un mécanisme important dans la physiologie (patho) de résistance à l’insuline et ses complications.
Bien qu’il y a des preuves substantielles que l’insuline augmente le volume sanguin microvasculaire (MBV) dans le muscle squelettique5,6, les mécanismes par lesquels ce qui se passe ne sont pas totalement comprise9. Vasodilatation endothélium-dépendante est essentielle dans de nombreux aspects de l’insuline vasculaire sensibilité21,22,23 à différents niveaux du système vasculaire. Sensibilité à l’insuline vasculaire peut se manifester par une relaxation induite par l’insuline des artères de résistance et de relaxation des artérioles pré capillaires pour augmenter l’échange microvasculaire perfusé superficie7,24, 25.
La microscopie intravitale (IVM) a été utilisée dans une variété de préparations de tissus, y compris les chambres du pli cutané de la face dorsale de souris26, mésentère de la souris et le rat27, modèles d’ischémie des membres dans la souris28 ainsi que la pochette de joues de hamster 29. échographie de contraste accentué (UFC) est une autre technique d’imagerie qui permet l’évaluation de la microcirculation dans cardiaque30 ainsi que le muscle squelettique,31. Il utilise les microbulles remplis de gaz inerte qui se comportent rhéologiquement comme les globules rouges et de rester entièrement dans la lumière vasculaire. Ces microbulles sont perfusion intraveineuse à débit constant pour atteindre un état stable. Une vague d’échographie de haute énergie, alors, peut être utilisée pour détruire les microbulles. Vitesse de réapprovisionnement des microbulles dans la région d’intérêt (ROI) représente la vitesse d’écoulement (MFV). L’intensité du signal total de l’image contraste représente le MBV. CEUS peuvent être effectuées à plusieurs reprises (aussi chez les humains) et il a fait progresser la compréhension de la dysfonction vasculaire qui se rencontre aux insulino-résistant (discuté dans Barrett et al. ( 32).
Dans la présente étude, les auteurs décrivent une nouvelle technique pour étudier le règlement de la perfusion du muscle, grâce à l’utilisation simultanée de IVM et UFC. Ici, nous nous concentrons sur les actions vasculaires de l’insuline dans le compartiment des adducteurs de la souris du membre postérieur. Ce compartiment est l’un des plus grands groupes de muscle squelettique chez la souris, ce qui permet des études d’absorption du glucose local dans un muscle représentatif. Ce compartiment est idéal pour IVM car la préparation et la visualisation des artères sont facilement accessibles par une intervention chirurgicale standardisée28. En outre, notre propre groupe et autres ont montré que l’UFC peut être utilisé dans ce compartiment33,34.
Un avantage de la technique combinée de IVM et UFC est la possibilité d’évaluer l’effet de l’insuline au niveau des plus grande et artérioles (aliments pour animaux ou la résistance des artères) et la microcirculation (lits capillaires) dans le même groupe musculaire. En outre, l’application simultanée des deux méthodes donne un aperçu de l’action temporelle de l’insuline au niveau des artères de résistance et microcirculation. Ceci combiné IVM et CEUS technique peut également être mis en œuvre dans d’autres domaines de la biologie vasculaire. Par exemple, le rôle de diverses protéines et certaines conditions physiopathologiques affectant l’endothélium peut être étudié à l’aide de modèles knock-out. En outre, les deux techniques peuvent servir dans une souris à plusieurs moments réduisant le temps et le coût de la recherche.
Nous avons développé une technique pour estimer simultanément des actions vasculaires de l’insuline sur les artères plus grandes (à l’aide de IVM) et la microcirculation du muscle squelettique (à l’aide d’UFC). Les étapes essentielles pour les mesures performantes et fiables sont : 1) exposer correctement l’artère gracilis sans saignement ; 2) empêchant la fuite de l’huile de paraffine se baignant l’artère ; 3) ayant un accès veineux brevet (canule de veine de queue) pour la perfusion de composés vasoactifs (insuline) et agent de contraste (microbulles).
L’étude de la dysfonction microvasculaire dans le muscle a gagné l’attention dans le contexte de l’obésité et l’insuline résistance14,25,39,40. L’impact négatif de l’obésité et la résistance à l’insuline sur la fonction vasculaire se manifeste à différents niveaux de l’arbre vasculaire. Désormais, différentes approches sont nécessaires pour évaluer ces changements. L’utilisation combinée de l’IVM et UFC techniques chez la souris même fournit un outil puissant pour quantifier les effets de l’insuline à différents niveaux du système vasculaire. IVM permet une visualisation directe et l’analyse quantitative de l’artère de résistance et CEUS permet pour l’évaluation des changements perfusion musculaire induite par l’insuline.
Étudier le compartiment de muscle adducteur présente plusieurs avantages. Les artères sont facilement accessibles et le caractère superficiel de l’incision permet de refermer l’incision de la peau avec un 5,0 résorbable stérile une fois l’expérience terminée. Les animaux ont été injectées par voie sous-cutanée avec la buprénorphine, après les expériences comme analgésique à une dose de 0,1 mg/kg et a permis de récupérer dans un environnement chaleureux. Les souris toléré la procédure très bien et nous avons vécu sans perte d’animaux ni d’infections des membres postérieurs chez les plus de 35 animaux étudiés. Cela rend possible pour le suivi ou étudier les animaux de manière longitudinale. Les animaux utilisés dans ces expériences, cependant, ont été anesthésiés à l’aide de 1,8 % par inhalation isoflurane équilibré avec l’oxygène coulant à 0,4 L/min dans un masque d’anesthésie. Contrairement à l’isoflurane anesthésie41,42, anesthésie FMA ne perturbe pas la sensibilité à l’insuline périphérique. Un plan d’avenir est d’étudier comment bien les souris récupérer de l’anesthésie de la FMA.
Le compartiment de muscle adducteur est également utile depuis divers composés vasoactifs médiation locale et effets vasculaires en aval peuvent être évaluées. Par exemple, l’application topique de ces composés dans le tissu cible est réalisable à l’aide de techniques superfusion28 ou manipulation chirurgicale et implantation des poignets à élution de médicament qui entoure les vaisseaux43. En outre, l’artère gracilis peut être isolé et étudié dans la myographe pression. Notre groupe et autres sont sont réunis des preuves substantielles expérimentale utilisant le myographe pression à documenter les effets de l’insuline et d’autres composés vasoactifs sur cette artère ex vivo36,37,38.
Une limitation inhérente à l’utilisation de la technique IVM est l’exposition chirurgicale du muscle et l’application de l’huile de paraffine pour stabiliser les vaisseaux. On ne sait ne pas si ces actions influent sur l’environnement natif de l’artère. Cependant, la Figure 3 a montre que le diamètre de la base de l’artère gracilis baignée dans l’huile de paraffine ne change pas considérablement. Il a été également démontré que l’huile minérale inhibe avec succès la diffusion de l’oxygène, protéger les tissus contre hyperoxique conditions44. En outre, l’huile contribue à réduire la variation du diamètre de la base des artères. C’est pourquoi nous préconisons d’utiliser de l’huile de paraffine et laissez reposer la préparation pendant au moins 30 min. À noter, l’utilisation d’une solution saline tamponnée au lieu d’huile – ou pas entraîné du tout – diamètres très variables et constriction du navire (données non présentées). En outre, à la fin des expériences, nous isolé les artères gracilis – baignées dans l’huile de paraffine – et testé leur réactivité dans le myographe pression ex vivo. Les artères baignée dans l’huile de paraffine ont réagi de la même façon pour contrôler les artères lorsque stimulée par l’insuline et l’acétylcholine (un vasodilatateur) (données non présentées). La vasodilatation induite par l’insuline cohérente montre clairement que le protocole IVM décrit dans la présente étude produit des résultats fiables.
L’avantage de l’application de ces deux techniques chez la souris même surmonte certaines des limitations intrinsèques d’une technique par l’autre : CEUS estime MBV dans le muscle intacts in vivo, mais les navires individuels ne peuvent être vus ; IVM permet de voir les navires individuels, bien qu’il ne peut pas estimer MBV. Un futur plan consiste à utiliser la microscopie IVM du muscle crémaster en combinaison avec CEUS du muscle adducteur du côté controlatéral. Cette modification peut fournir une estimation de la MBV (à l’aide d’UFC) et un accès direct et optique pour les capillaires (à l’aide de vecteurs). Le protocole peut être modifié ; le connecteur 4 broches utilisé pour la canule de la queue peut être commuté sur un connecteur 5 broches. Par la présente, nous pouvons éviter de détacher le tube de l’anesthésie lors de l’exécution de la deuxième mesure CEUS (décrite au point 2.9). Dans notre expérience, les souris toléré le protocole actuel. Une autre modification qui peut être faite au présent protocole est le taux d’insuline pince utilisé. Nous avons utilisé 7,5 taux mU/kg/min pince qui est considérée comme supra-physiologique. Selon l’étude, un taux inférieur de pince l’insuline (par exemple 3 mU/kg/min) peut être utilisé.
Alors que nous avons trouvé le protocole décrit fiables, il y a des limitations spécifiques qui ont besoin d’attention. Il existe des situations où la mesure du diamètre artériel n’est pas optimale. Exécuter les étapes de préparation nécessite une expérience avec le modèle. Il est crucial que l’huile de paraffine ne fuit pas dans l’environnement de navire en complétant avec de l’huile nouvelle va déranger le navire et changer le diamètre, rendant nécessaire de laisser le reste de l’artère pendant 30 min. En outre, la réflexion de la lumière (décrite à l’étape 1.14 du protocole) sur la surface de l’huile de paraffine était parfois trop lumineuse, rendant difficile visualiser l’artère. Cela peut être contrecarrée en ordonnant à la source de lumière afin que la lumière tombe sous un angle à l’huile de paraffine, surface et parallèle à l’artère.
En conclusion, la combinaison de l’IVM et UFC techniques décrites dans cette étude permet de quantifier les différents effets de l’insuline à différents niveaux du système vasculaire. IVM de l’artère gracilis donne un aperçu des changements vasculaires en amont contribuant à perfusion microvasculaire en aval, mesurée à l’aide d’UFC. Nous plaidons pour la combinaison de plusieurs techniques expérimentales chez la souris même afin de mieux évaluer la fonction vasculaire.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Ing. Duncan van Groen pour la programmation de logiciel d’analyse de l’image (ImageGrabber) utilisé dans cette étude. Le financement de cette recherche a bénéficié d’une subvention VIDI de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (fief 016.136.372).
C57BL/6 Mice | Charles river | Mice used were bred in-house | |
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system | VisualSonics inc. | ||
MS250 non-linear transducer | VisualSonics inc. | ||
Vevo 2100 software | VisualSonics inc. | ||
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves |
Vortex | VWR international | 58815-234 | |
Heating pad | Pantlab | ||
Freestyle Precision Xceed | Abbott | To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp | |
Insulin Novorapid | Novo Nordisk | ||
Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1083421000 | |
Buffered saline solution | B. Braun | 152118062 | |
PE-20 medical tubing | Becton, Dickinson and Company | 427405 | |
Needle, 27 Gauge | Becton-Dickinson & Co | 305109 | |
Medical tape | 3M | ||
Ultrasound probe holder | Built In-house | ||
Cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
Creme depilator | Multiple Equivalent | ||
Gel tissue adhesive | Derma+flex | GA30005-2222 | |
Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
Small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
Straight forceps with fine tip | Fine Science Tools (FST) | 11251-20 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
Camera | Basler | scA1390-17gc | |
Image Grabber program | Built in-house | Image acquisition system | |
Timer | VWR | 33501-418 | |
Syringes, 1 ml | Fisher | 14-817-25 | |
Light source, fiber-optic | Schott | KL1500 | Ideally has adjustable arms |
Paraffin oil | Multiple Equivalent | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbubbles | |||
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
polyoxyethylene stearate | Sigma | p3440 | |
perfluorobutane gas | F2 Chemicals | C4F10(g) | |
Decon FS200 ultrasonic bath | Decon Ultrasonics Ltd | ||
Vialmix | Lantheus Medical Imaging | 515370-0810 | |
Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc |