JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

Published: January 05, 2017
doi:
10.3791/54861
, ,
1Structural Biology Group,European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences,Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes,Institut de Biologie Structurale

Summary

קביעת מבנה פתרון של חלבון על ידי פיזור קטן זווית קרני רנטגן (SAXS) דורש דגימות monodisperse. כאן, אנו מציגים שתי אפשרויות על מנת להבטיח עיכובים מינימאליים בין הכנת מדגם ורכישת נתונים: כרומטוגרפיה בגודל הדרה מקוון (SEC) כרומטוגרפיה היון-Exchange Online (IEC).

Abstract

רנטגן פיזור זווית קטנה ביולוגית (BioSAXS) היא טכניקה רבת עוצמה בביולוגיה מולקולרית מבניים המשמשים לקביעת מבנה פתרון, גודל החלקיקים וצורה, קרקע-נפח יחס של מקרומולקולות. הטכניקה ישימה מגוון מאוד רחב של מצבי פתרון פורשים מגוון רחב של ריכוזים, ערכי ה- pH, עוצמות יוניות, טמפרטורות, תוספות וכו ', אבל המדגם הוא נדרש להיות monodisperse. אזהרה זו הובילה ליישום מערכות כרומטוגרפיה נוזלית על beamlines SAXS. כאן אנו מתארים את השילוב במעלה הזרם של הדרת גודל (SEC) ואת היון-חילופי כרומטוגרפיה (IEC) על beamline, שיטות שונות עבור חיסור רקע אופטימלי, והפחתת נתונים. כדוגמא, אנו מתארים כיצד אנו משתמשים SEC- ו- IEC-SAXS על שבר של D5 vaccinia וירוס החלבון החיוני, מורכב תחום helicase D5N. אנו קובעים צורה הכללית שלה ועל משקל מולקולרי, המתאר את מבנה hexameric של החלבון ה.

Introduction

BioSAXS הוא כלי רב עוצמה כדי לקבוע את הצורה של אובייקטים בגודל ננו 1-4. הפיזור של קרני X על ידי תמיסה המכילה מולקולות, בגודל בטווח ננומטר, נרשם בזוויות מאוד נמוכה. מגוון זוויתי זה מכיל מידע על פרמטרים גלובליים: רדיוס הסתובבות; מרחק intraparticle הגדול; צורת החלקיקים; והמידה מתקפלים, denaturation, או הפרעה. הטכניקה אינה דורשת גבישים, ואת מקרומולקולה נשאר בתמיסה ובכך יכול להישמר בתנאים מחקו פרמטרים חשובים מסוימים של התא, כגון כוח יוני, pH ועוד ידע של גורמים אלה עשויים לסייע לקבוע, למשל, מדינת oligomeric הרלוונטית מבחינה הפיזיולוגית של חלבון של עניין או כדי לאמת את מודל מוצע של קומפלקס. האפיון של אינטראקציות בין חלבונים בתנאי חיץ שונים, יצירת מודלים של תחומים חסרים, העידון של מודלי הומולוגיה, ואת דהסיום המדינות מקופלות בדידות פרש יכול להתבצע במהירות ובקלות 5.

כמו עם כל הטכניקה, יש BioSAXS חולשות פנימי: דגימות מצטברים או מפוגל, תערובות של חלקיקים, דגימות הטרוגניות, נזקי קרינה, ואת חוסר התאמה חיץ עלול לגרום להצגת נתונים בלתי וניתנת לפרשנות. עבור שיטות ניתוח רבות, ההנחה היא במרומז כי המדגם הוא monodisperse, דרישה כי היא לעתים קרובות קשה להשיג בפועל. במקרים רבים, את ההשפלה של המדגם הוא עדין ולא ניתן לאתר את הנתונים בפני עצמה, וכל ניסיון לפרש את הנתונים נותן תוצאות לא מדויקות או אפילו מטעה. כדי להתגבר על המכשולים הללו, השילוב של כרומטוגרפיה בגודל הדרה (SEC) ו SAXS יושם על beamlines רב על מנת להבטיח את איכות נתונים ולעשות את הטכניקה הזו לנגישה יותר עבור דגימות קשות יותר ויותר 6-11. לאחרונה, הוספנו שיטה חדשה לרפרטואר ידי פיתוח-חילוף יונים באינטרנטכרומטוגרפיה (IEC) -coupled 12 SAXS. טכניקות הן פותחות SAXS למגוון רחב של חלקיקים ביולוגיים לשעבר בלתי אפשרי לנתח. הבחירה של איזו שיטה להשתמש תלוי מאפייני biophysical של חלקיקים של עניין.

SEC מפריד מקרומולקולות על ידי גודלם, לפיה לפחות הבדל של 10% מסה מולקולרית לכאורה דרוש ההפרדה. מגבלות פיזיות של הטור המאפיינים הפיזיולוגיים של דגימות, כמו משטחים הידרופובי, גמישות, וחוסר יציבות, גם לסבך איסוף נתונים, ניתוח, ופרשנות.

יון-חילופי כרומטוגרפיה, המפריד מולקולות מבוססות על התשלום שלהם, ומכאן, הזיקה המחייבת שלהם לעמודת IEC, ניתן להשתמש במקום או בנוסף ל- SEC. המטען הכולל ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי ה- pH, או תשנה את ריכוז המלח של למאגר, מתן שיטה פשוטה יחסית עבור המבוקרת אלution של מולקולות מהעמודה IEC. באמצעות תשלום, הפרדת סוגים דומים וגדלים של מולקולות, אשר שאחרת קשה להפריד, ניתן לבצע באופן שגרתי עם חברת החשמל. בנוסף, IEC יש את היתרון של להיות מסוגל להתמודד עם דגימות מדוללות, המאפשר אחד כדי למנוע את צעדי הריכוז, אשר נושאים את הסיכון הפוטנציאלי של denaturing החלבון. למרבה הצער, כפי המטענים מאוד מדגם תלויים, IEC דורש אופטימיזציה לגבי pH ועל ריכוזי מלח 13,14.

עבור חלבונים רבים שקשה לבטא, לטהר, או שניהם, רק בכמויות קטנות של מדגם זמינות ללמוד. חשוב להיות יעיל כדי למזער את מספר צעדי טיהור, ולכן ההפסדים. מסיבה זו, צעד הטיהור האחרון מחובר מוקדם אל רכישת נתוני SAXS, על מנת להגדיל את הסבירות של איסוף ערכת נתונים טובה.

כאן, אנו מציגים ולהשוות SEC-SAXS ו- IEC-SAXS באינטרנט. שתי הטכניקות יושמו על beamline BioSAXS BM29 במתקן קרינה Synchrotron האירופי (ESRF) גרנובל, 15 בצרפת. כמקרה מבחן, השתמשנו תחום D5N ו helicase של החלבון וירוס vaccinia D5, שהיה די קשה לנתח בשיטות אחרות מבנית. הווירוס vaccinia הוא חבר של המשפחה Poxviridae והוא 98% זהה לנגיף אֲבַעבּוּעוֹת, הגורם אבעבועות קטנות. השימוש במערכת vaccinia, אנחנו לומדים את מכונות שכפול, התמקדות כאן על D5 helicase-primase חיוני.

D5 הוא חלבון 95-kDa עם N-terminal Archeo-איקריוטיים primase (AEP) מושלם 16 ואחריו באזור אשכול ציסטאין (מיל. 240-345) 16. בהמשך לכיוון הסופית- C מגיע מושלם D5N (מיל. 340-460), אשר מזוהה תמיד עם helicases D5-סוג, ולבסוף superfamily 3 (SF3) תחום helicase (מיל. 460-785) 17 (Figurדואר 1A). תחום helicase של D5 בונה מבנה טבעת hexameric מה שדרוש חזק מחייב ל- DNA. בזכות מחקרי SAXS וא"מ האחרונים, את המבנים ברזולוציה הנמוכה של primase ובתחומי helicase כיום ידועים 18.

כאן, אנו מראים כיצד להשתמש בטכניקות כרומטוגרפיה באינטרנט מיושם על beamline BioSAXS BM29 בבית ESRF כדי לקבל תובנות לתוך המבנה של שבר בטרמינל C-(שאריות 323-785) של D5.

Protocol

.1 תיאור ההכנה המנותקת ודור דגימת חלבון מחיק D5 הערה: מבנה D5 323-785 (איור 1A) שוכפלה, הביע, וטיהר כמתואר 18. Clone לבנות לתוך וקטור pProEx HTB בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) על D5R באמצעות פריימרים 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 '5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' ו תערובת התגובה PCR עם פולימראז, על פי עצתו של היצרן. לטהר את שברי PCR באמצעות עמודות ספין, על פי עצתו של היצרן. לעכל את שברי PCR ואת הפלסמיד עם NcoI ו אנזימי הגבלה HindIII, בעקבות המלצות של היצרן עבור הרכב חיץ וזמן הדגירה. הפעל את שברי על ג'ל agarose 1% חיץ 0.5x טה (20 מ"מ טריס, 10 מ"מ חומצה אצטית,ו 0.5 mM EDTA) ו להכתים את הג'ל עם צבע DNA. לחשוף את הג'ל לאור UV. זהירות: תלבש ציוד בטיחות אישי! חותך את הלהקות של שברי PCR מתעכלים הפלסמיד מתעכל לטהר את ה- DNA באמצעות ערכת טור ספין ג'ל לניקוי, בעקבות המלצות היצרן. ולקשור את שברי PCR מטוהרים לתוך פלסמיד באמצעות ערכת קשירה מהירה, בעקבות המלצות היצרן. Transform באמצעות הלם חום המוצר מן תגובת הקשירה לתוך חיידקים המוסמכות אופטימיזציה עבור הגברת פלסמיד. להוסיף מחצית מוצר הקשירה ל בקבוקון של חיידקים. דגירת צינור התגובה על קרח למשך 20 דקות. דגירת הצינור ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. מניחים את הצינור על קרח במשך 2 דקות. הוסף 1 מ"ל של לוריא Bertani (LB) מרק (מילר) ללא אנטיביוטיקה ולתת התאים להתאושש על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ספין למטה התאים ב 16,100 XG FOr 3 s בצנטריפוגה השולחן microtube ולהסיר את רוב של המדיום. מורחים את התאים על צלחת אגר LB עם אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​הסופי) ולתת מושבות לגדול ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שים המושבה לתוך 3 מ"ל של LB עם אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​הסופי) ולגדול תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 160 סל"ד לילה. פעל לפי ההוראות של ערכת miniprep כדי לחלץ את הפלסמיד. שלח מדגם של פלסמיד עבור סידור ולנתח את הרצף עבור היעדרן של מוטציות ועבור ההכנסה הנכונה. להפוך את pProEx HTB D5 323-785 לבנות לתוך חיידקים אופטימיזציה עבור ביטוי חלבון (להשתמש 1 μL ובצע את השלבים בשלב 1.1.7). מורחים את החיידקים על צלחת אגר LB עם אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​הסופי). כדי ליצור תרבות התחלה, הניח את המושבה אחד 300 מ"ל של LB עם אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​הסופי) ו לגדל את החיידקים על 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 160 rלילה pm. לחסן 12 x 1 ליטר של LB בנוכחות אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל הסופי), כל אחד עם 20 מ"ל של התרבות המתנע 323-785 חיידקים pProEx HTB D5 ב 37 ° C עד OD 600 = 0.3 הוא הגיע. מנמיכים את הטמפרטורה ל 18 מעלות צלזיוס, לגרום ביטוי ב OD 600 = 0.5 עם IPTG 1 מ"מ. דגירת התרבויות, רועדת להם 160 סל"ד ו -18 מעלות צלזיוס למשך הלילה. קציר את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 50,000 XG ו ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. Resuspend את כדורי חיידקי כ 150 מ"ל של חיץ תמוגה (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ MgCl 2, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, ו -10% גליצרול) עם מעכבי פרוטאז 1x ו -25 יחידות ( U) / 10 מ"ל DNase. Lyse החיידקים באמצעות sonication על הקרח (בדיקה 1 אינץ ', כוח של 50%, 0.5-s הדופק, 0.5 s-הפסקה, 3x 5 דקות). טען את supernatant על עמודה זיקה ניקל (Ni-טור, נפח המיטה 1.5 מ"ל), ולשטוף אותו עם 10 כרכים עמודה (CV) של binding חיץ (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, ו -10% גליצרול), 10 קורות חיים של חיץ כביסה (50 mM Tris-HCl [pH 7], 1 M NaCl, 10 β-mercaptoethanol מ"מ, ו -10% גליצרול), ו -10 CV של לשטוף imidazole (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, 10% גליצרול, ו -30 imidazole מ"מ). Elute את D5 323-785 (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, 10% גליצרול, ו -200 imidazole מ"מ). בדוק את השלבים לטיהור שונות באמצעות סולפט dodecyl נתרן (SDS) ג'ל אלקטרופורזה -polyacrylamide (עמוד). טען 2-20 μL של כל שלב טיהור הזרימה דרך מעורבב עם צבע טעינת 1x (2x: 4% SDS, 20% גליצרול, 120 מ"מ טריס-HCl [pH 6.8], ו- 0.02% משקל / נפח bromophenol כחול) על 10 % SDS ג'ל ולהפעיל אותם ב 200 V ב 1x Laemmli הפעלת המאגר (25 מ"מ טריס, 0.192 M גליצין, ו -0.1% SDS). הכתם ג'ל עם פתרון כחול Coomassie מוכן לשימוש. EXChange למאגר של החלבון eluted עם חיץ מחייב באמצעות טור desalting פי הוראות היצרן. קליב התג שלו על ידי הוספת וירוס הטבק Etch גרעינית-הכללה-a endopeptidase (TEV, 1 מ"ג / 100 מ"ג של חלבון) לפתרון החלבון. דגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה. בדוק את מערכת העיכול על ידי ביצוע SDS-PAGE (ראה שלב 1.5) לאזן את עמודות Ni חיץ מחייב. תנו פתרון חלבון לעבור ולשטוף את החרוזים עם 2 קורות חיים של חיץ כביסה imidazole תוך איסוף את הזרימה דרך. לרכז את החלבון באמצעות concentrator צנטריפוגלי לנפח סופי של 0.5 מ"ל. להזריק את חלבון מרוכז על עמודה בגודל הדרה equilibrated עם חיץ סינון ג'ל (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 מ"מ NaCl, 10% גליצרול, ו 1 מ"מ dithiothreitol [DTT]). אסוף את הזרימה דרך שברים 0.5 מ"ל. בדוק את הנוכחות והטוהר של חלבון בדגימות שיא ידיביצוע SDS-PAGE (ראה שלב 1.5). מערבבים את השברים של השיא eluted של D5 323-785. לדלל את המדגם ל -25 מ"מ NaCl ו גליצרול 5%, תוך שמירה על ריכוזים טריס ו DTT קבוע (עבור 5 מ"ל של תמיסת חלבון 20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 מ"מ NaCl, 10% גליצרול, ו 1 מ"מ DTT, הראשון להוסיף 5 מ"ל של 20 mM Tris-HCl [pH 7] ו 1 מ"מ DTT, ולאחר מכן להוסיף 20 מ"ל של 20 mM Tris-HCl [pH 7], 5% גליצרול, ו 1 מ"מ DTT). טען את המדגם על טור יון-חליפין. השתמש הצפת (20 מ"מ טריס [pH 7], 25 mM NaCl, 5% גליצרול, ו 1 מ"מ DTT) חיץ B (20 מ"מ טריס [pH 7], 1 M NaCl, 5% גליצרול, ו 1 מ"מ DTT) כדי ליצור שיפוע מלח מ -25 מ"מ עד 1 מ ' אסוף החלבון eluted שברים 1.5 מ"ל. בדוק את הנוכחות והטוהר של חלבון בדגימות שיא ידי ביצוע SDS-PAGE (ראה שלב 1.5 ואיור 1B) Reconcentrate הפתרון החלבון concentrator צנטריפוגלי לנפח סופי של 0.5 מ"ל. Rerun החלבון מרוכזים על עמודה בגודל הדרה חיץ ג'ל סינון (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 מ"מ NaCl, 5% גליצרול, ו 1 מ"מ DTT; ראה שלב 1.11). 2. איסוף נתונים הערה: זמן קרן בקשה מוקדם ככל האפשר. לקבלת ESRF, הנחיות על סוגי גישה זמינה ועל איך להגיש בקשה ניתן למצוא בכתובת: http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . לאחר קבלת ההצעה והזמנה לניסוי, כל המשתתפים צריכים להשלים הדרכה בטיחותית. לאחר אימות של אימונים, למלא את "טופס א '(דרך פורטל המשתמשים ESRF) להכריז החוקרים ביקור beamline לניסוי, יחד עם מידע הבטיחות הנדרש על דגימות. יצירת קשר עם איש קשר והמקומי לדון בניסוי. איסוף הנתונים SEC-SAXS הערה: לקבלת onlטיהור ine, השתמש כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC) המערכת המותקנת בבית BM29. המערכת כוללת של מסלק גזים ב-קו, משאבת בינארי, שסתום לבחירה חיץ והדרגות, גידול autosampler, פוטו מערך UV-VIS, וכן conductometer. הוא מחובר ישירות נימי זרימת דרך של יחידת חשיפת SAXS 19. שים 1 מ"ל של חיץ ג'ל סינון בצד. חבר את בקבוק חיץ למערכת SEC (ברירת המחדל היא פורט A). בחר את קצב הזרימה תלוי בעמודה בשימוש. הערה: הטור בגודל הדרה משמש כאן, את קצב הזרימה הוא 0.1 mL / min. הגדר את הלחץ המקסימאלי עבור העמודה, לרשום את הלחץ בחזרה, ולהגדיר את זמן הרכישה ל -1.2 CV לפחות. שטוף את משאבות צינורות הזרם באמצעות פונקציית "אוטומט הטיהור". מתן עד שהמערכת מתמלאת החיץ ולחבר את הטור. לאזן את העמודה על ידי עובר לפחות 1.5 CV. משתלבלול ולמדוד למאגר להפריש בשלב 2.1.1, באמצעות מחליף מדגם לשלוט על וריאציה של האות בשל נזקי קרינה. רק להמשיך אם אין נזק קרינה למאגר. החלף את מערכת בקרת beamline למצב HPLC. ערכו מבחן ריצה של חיץ, איסוף 200 מסגרות עם 1 s לכל מסגרת. רשום את מספר הספירות שנתנו הגלאי בעלילה העוצמת סכמה. הערה: האות צריך להתאים למאגר בעבר נמדד, ואת עוצמת סיכם לאורך זמן צריך להישאר קבוע. אם האות אינו תואם או אינו קבוע, איזון יותר של המערכת נדרשת. ספין למטה מדגם ב 13,000 XG בצנטריפוגה השולחן microtube עבור 10 דקות לפחות. מלאו את המדגם לתוך בקבוקון זכוכית HPLC תואם (בתנאי) והכניס אותו לתוך מזרק אוטומטי. הערת העמדה היטב. משתלב הלול הניסיון באמצעות הליך רגיל, כפי שמוסבר הדרכת בטיחות המשתמש. היכנס וליצור תיקייה לאחסון נתונים באמצעות תוכנות שליטה beamline. לתכנת את מערכת HPLC באמצעות התכונה "תצווה המהירה". הגדר את מקום האחסון עבור נתוני UV לתיקייה שנוצרה בשלב 2.1.10. הקפד להפעיל את המרת ASCII האוטומטית של נתוני UV, לאחסון בקובץ ASCII באותה התיקייה. בחר את עוצמת הזריקה ומצבה טוב. מוסיפים את המדידה לתור ידי לחיצה על כפתור "התחל". התוכנה תבקש להציל את המנה. היכונו חיסכון, אבל לא ללחוץ על כפתור "שמור", כמו זה יפעיל אוטומטית את המדידה. הגדרת פרמטרים באיסוף הנתונים תוכנות שליטה beamline. בחר את מספר מסגרות כך שבפעם איסוף נתונים הכולל הוא לחרוג מעט זמן הרכישה שהוגדר בשלב 2.1.2. פתח את תריס בטיחות ולהתחיל איסוף נתונים SAXS באמצעות תוכנות שליטה beamline. ודא כי הנתונים הם correctly רכש. השווה את הנתונים שנאספו לאחרונה על הנתונים שנאספו בשלב 2.1.6 ולבדוק כי מספר הספירות בעוצמת סיכם נשארת קבועה לפחות 100 מסגרות ותואם את ערך משלב 2.1.6. הפעל את ה- SEC מנוהל על ידי לחיצה על הכפתור "השמור", כפי מוכן בשלב 2.1.11, ורשום את מספר מסגרת מוצגי תוכנת camserver כאשר ההזרקה הושלמה רכישת נתוני UV מתחילה. לאחר איסוף הנתונים, לפתוח את מסד נתוני ISPyB 20 ב פתח את כרטיסיית "נתוני רכישה" ולחץ על "Go" כדי לגשת ערכת הנתונים והתוצאות של הניתוח האוטומטי 21. איסוף הנתונים IEC-SAXS הערה: במקום שיפוע ליניארית רציף להחיל מקובלות הרבה יותר בניסויי IEC, להשתמש שיפוע צעד חכם שבו הכמות של החיץ B היא גדל בצעדים שנקבעו מראש בדידים. צור את התוכנית HPLC עבור samplדואר ללא ריצה חיץ. לתכנת שיפוע צעד חכם החל מ 0% חיץ B והגדיל ב -5 נקודות אחוז אחרי שני קורות חיים עד 100% של החיץ B הוא הגיע. שים קצת של כל חיץ בצד. חבר את הבקבוק עם החיץ דל מלח ליציאה ואת האחד עם B החיץ גבוה המלח ב נמל בחר את קצב הזרימה ולהישאר מתחת לגבול הלחץ של הטור (בדוגמה זו, 1 mL / min). כמו בשלב 2.1.3, לשטוף את משאבות צינורות זרם באמצעות פונקציית "אוטומט הטיהור". לאזן את המערכת במאגר דל מלח (ראה שלב 1.15) ולחבר את עמודת שער יון. חכה עד הטור הוא equilibrated לחלוטין (לפחות CV 1.5). השתמש חיץ להפריש בשלב 2.2.2 לבחון מאגרים A ו- B עבור נזקי קרינה באמצעות מחליף מדגם, כמו בשלב 2.1.5. בדוק למאגר יוצא של הטור, כמו בשלב 2.1.6. השווה את האות לאות של הצפה רשמה בשלב 2.2.6. הערה שובמספר הספירות בעלילה עוצמת סיכם. צור תיקייה לאחסון נתונים עבור בטווח החיץ. הגדרת אוסף נתונים במצב מערכת HPLC. בחר את מספר מסגרות כך שבפעם איסוף נתונים הכולל הוא העולה על הזמן הכולל של ריצת IEC (ראה שלב 2.2.1). פתח את תריס בטיחות ולהתחיל את איסוף הנתונים SAXS. ודא כי הוא ממשיך בצורה נכונה פעמיים לבדוק כי עוצמת סיכם נשאר קבוע לפי השווי בצעד 2.2.7 עבור 100 מסגרות לפחות. השתמש בתכונת "ההפעלה היחידה" של תוכנת HPLC ולהתחיל את שיפוע הצעד חכם מתוכנת בשלב 2.2.1. עבור הזריקה, להגדיר את מספר בקבוקון ל -1 כדי להזריק לא מוצא מדגם בשלב זה. רשמו את מספר מסגרות רכשה כתוכנית מתחיל. צור את תכנית HPLC עבור בטווח המדגם. לתכנת שיפוע צעד חכם החל מ 0% של חיץ ב להעריך את אחוז חיץ B בכל השיא נמדד מחובר בשלב 1.1.5 ( <strאונג> איור 1B). גדר לפחות 3 שלבים בדיוק 1 נקודת אחוז מתחת ו -1.5 נקודות מעל הפסגות של עניין, כל אחד 2.5 CV (תרשים 1C). הוספת שלב אחרון ב B חיץ 100% עבור 2.5 CV. ספין למטה מדגם ב 13,000 XG בצנטריפוגה השולחן microtube עבור 10 דקות לפחות. לדלל D5 323-785 לתוך ריכוז מלח של חיץ (25 מ"מ) על ידי לערבב אותו עם 20 mM Tris-HCl [pH 7], 10% גליצרול, ו 1 מ"מ DTT. טען המדגם באופן ידני על הטור. שים למאגר צינורית הזנה לתוך המדגם מדולל אחרי שעצר המשאבות כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. ניתק את העמודה מן הגלאי לאסוף את הזרימה דרך ישירות מהעמודה. כאשר המכל מדגם כמעט ריק, להחזיר את צינור ההזנה לתוך חיץ (שוב משתהה המשאבות תוך העתקת הצינור) ולהפעיל מחדש את השאיבה עם חיץ להעביר את המדגם מתוך הצינורות לעמודה. לאחר המדגם כולו כברנטענים, להעביר 2 CV של חיץ, ולאחר מכן חבר מחדש את עמודת הגלאי. לקבלה בטווח המדגם, ליצור תיקייה לאחסון נתונים. פתח את תריס בטיחות ולהתחיל את איסוף הנתונים SAXS. ודא כי איסוף הנתונים ממשיך כראוי ולבדוק כי עוצמת סיכם נשאר קבוע לפי השווי בצעד 2.2.7 עבור 100 מסגרות לפחות. השתמש בתכונת "ההפעלה היחידה" של תוכנת HPLC להתחיל שיפוע הצעד חכם מתוכנת בשלב 2.2.12. עבור הזריקה, להגדיר את מספר בקבוקון ל -1 כדי להזריק לא מוצא מדגם בשלב זה. רשמו את מספר מסגרות רכשה כתוכנית מתחיל. פתחו "נתוני רכישה" ב ISPyB 20 ולחצו על "Go" כדי להסתכל סט נתונים והניתוח האוטומטי 21. לייצא את הנתונים UV ממערכת HPLC לפורמט ASCII באמצעות תוכנת "ניתוח Postrun". 3.SEC-SAXS לצמצום נתונים וניתוח פתח את נתוני רכישת נתוני ISPyB ידי לחיצה על הכפתור "המשך". לקבוע בראייה הכוללת את המסגרות של איסוף נתוני SAXS מתאים שיא elution. ודא כי הרדיוס של הסתובבות הוא יציב לאורך השיא. ודא תיקון החיץ האוטומטי בוצע כהלכה. מסגרות טען מהחלק המרכזי של השיא לתכנית שמבצעת מניפולציות עם נתוני SAXS ניסיוני קבצי 22 ומחשב את ממוצע של אותם. ואז, טען את קובץ חיץ שנוצר באופן אוטומטי לבדוק אם אזורי Q הגבוה של המסגרות בממוצע ואת משחק מסגרות חיץ. השווה את המסגרות שרכשו לאורך השיא באמצעות מבחן CORMAP כמותית 23. טען את וההורדות נוצרו באופן אוטומטי (* קבצי _sub.dat) של מסגרות מכסה את האזור של עניין. קנה מידה אותם זה לזה על ידי לחיצה על כפתור "קנה מידה". comparדואר אותם באמצעות התכונה "השוואת נתונים". לא צריך להיות שום שינויים שיטתיים בין המסגרות ברחבי השיא. פתח את כל * -_ מסגרות sub.dat עניין, למזג אותם באמצעות הלחצן "מיזוג", ולשמור את הקובץ הממוזג בפורמט .dat. לקבוע את הרדיוס של הסתובבות עם "רדיוס סבוב" הכלי בתכנית, וציין נקודת הנתונים הראשונה בטווח Guinier עבור חיתוך מאוחר של הנתונים ברזולוציה נמוכה. קבע את פונקציית התפלגות זוג למרחקים עם הכלי "הפצת מרחק" בתכנית ולשמור את קובץ .out וכתוצאה מכך כפי gnom.out. דוגמנות 4. מלכתחילה על מכונת יוניקס, להפעיל תכנית שיקום מודל מלכתחילה 40 x ab ללא הגבלות סימטריה. צור תיקייה חדשה ולהעתיק את קובץ gnom.out אליו. הפעל את התכנית כדלקמן: עבור ((i = 1; i <= 40; i ++)); לעשות dammif gnom.out -MS -p dammifp1_ $ i; דאחד בדומה לכך, להפעיל תכנית שיקום מודל מדעיקרא עם הגבלות סימטריה במשך שש-פי סימטריה בתיקייה שנייה: עבור ((i = 1; i <= 40; i ++)); מטלות dammif gnom.out -MS -s P6 -p dammifp6_ $ i; בוצע יישר כל קבצי פלט תכנית שיקום מודל מבראשית (* -1.pdb). בשתי תיקיות צעדים 4.1 ו -4.2, לרוץ damaver -a * -1.pdb. פתח את האיחוד של כל הדגמים (damaver.pdb), כמו גם את המודל המסונן לכרך (damfilt.pdb) הנכון תוכנה להדמיה מולקולרית מתאימה 26 ולהשוות אותם. פתח את קובץ damsel.log בעורך טקסט. המודל מופיע בתור "הייחוס" בתחתית של הקובץ הוא המודל המייצג ביותר. 5. הפחתת נתוני IEC-SAXS, ניתוח, ו דוגמנות בתכנית שמבצעת המניפולציה עם קבצי נתוני SAXS הניסיונות 22, לטעון כ -50 SAXS מסגרות מכל צעד ערבוב שלבטווח החיץ, ולחץ על הכפתור "הממוצע", ​​ולשמור את התוצאות. בהתבסס על תוצאות העיבוד האוטומטי הזמינות באמצעות ISPyB, לזהות אילו מסגרות של הניסוי תואם את elution של החלבון ולוודא כי (הראשוני) הרדיוס של הסתובבות הוא יציב לאורך השיא. טען את המסגרות לתכנית מניפולצית קבצי נתוני SAXS ניסיון 22 ומחשבים את הממוצע של אותם, כפי שנעשה עבור מסגרות החיץ (ראה שלב 5.1). לאחר מכן, לטעון את קבצי החיץ שנוצרו בשלב 5.1 ולהשוות האזורים הגבוה q (מעל 4.2 ננומטר -1) למצוא חיץ התואם את הממוצע מהפסגה. הערה: לא צריך להיות שום שיטתי לקזז בין הממוצע מהפסגה ואת החיץ. אם עקומת מדגם נראה ליפול בין שתי עקומות חיץ, לשרבב עקומות שלהם על ידי חישוב הממוצע. פחת למאגר מזוהה ההתאמה הטובה ביותר מהעקום הפיזור הממוצע של שבר השיא ולשמור את subtr וכתוצאה מכךקובץ פעל. בנוסף, ליצור עקומות נגרעו באמצעות עקומות חיץ הממוצעות ממדרגות הערבוב לפני ואחרי להעריך את השגיאה של החיסור. חזור על שלבים 5.3 ו -5.4 בנפרד עבור החצאים השמאלי והימני של השיא ולהשוות את התוצאות לאלו משלב 5.4 כדי לבדוק יציבות של האות לאורך השיא. בצע את שלבי 3.5 ו -3.6 עבור כל שלוש העקומות המופחתות בשלב 5.4. השווה את התוצאות עבור כל שלוש העקומות המופחתות. הערה: רק תוצאות שנותרו חזק בטווח השגיאה של חיסור אפשר לסמוך. בצע דוגמנות כמו שלבי 4.1 ו -4.2 עבור החיסור הטוב ביותר שזוהה בשלב 5.3. עקוב בשלב 4.3 ל 4.5 עד ליישר הדגמים ולזהות את אחד הנציג ביותר. 6. השוואה של התוצאות ולהפעיל תכנית כדי להרכיב מבני 3D 12 על מודלי הנציג של ה- SEC (שלב 4.5) עלד נתוני IEC-SAXS (שלב 5.9) עם סימטרית P6: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb ייבא את model_sec.pdb ואת-r.pdb model_iec לתוך תוכנה להדמיה מולקולרית. פתח את קבצי .fir של modelsec.pdb ואת-r.pdb modeliec בגיליון אלקטרוני וליצור גרף 2D של עקומות פיזור ניסיוניות ומחושבות.

Representative Results

התוצאות של ניתוח משתנה ללא מודל מפורטים בטבלה 1. האנליזה של נתוני D5 323-785 SEC-SAXS הראתה הערכת מסה מולקולרית (מניתוח Porod) של 345 kDa לעומת 338 kDa, ציין באמצעות IEC-SAXS. שניהם תמימי דעים עם המוני צפוי של 6 פעמים 53.5 kDa (321 KDA) עבור hexamer. הדוגמנות מדעיקרא של שתי קבוצות הנתונים בוצע ללא סימטריה שהוטלו (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) ושימוש סימטריה C6 (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). כמו ההתקפים הכוללים את נתוני פיזור עבור השחזורים הם דומים בשני המקרים (האיור 1D ו- E), סימטרית C6 ניתן להניח. לפיכך, המודל המתאים למבנה חרוט דמוי משושה עם ערוץ מרכזי, המופיע חסום חלקית (SEC: איור 1F; IEC: <strאונג> 1G איור, כיסוי איור 1H). בחינת דגמים בודדים לפני המיצוע מראה כי חסימה זו עשויה להיות פועל יוצא של תהליך המיצוע. איור 1: ניתוח נתוני SAXS והשוואה של D5 323 -785 (איור מותאם הפניות 12 ו -18). א) מבנה תחום סכמטי של חלבון D5 ו D5 323-785. B) מנותק יון-חילופי הכרומתוגרמה עם ציון של שלוש פסגות. עקומת אורנג ': ספיגה ב 280 ננומטר (au), עקומה כחולה: אחוז החיץ ב האחוזים של חיץ B על הפסגות מסומנות. C) chromatogram באינטרנט יון-חליפין. מפתח צבעים כמו ב בנוסף, עוצמת הנמדד הוא מסומנת בירוק. א העקומה הפיזור הניסיוןnd מחושב שהקו של המודל מתקבל על ידי ה- SEC-SAXS D) וחברת החשמל E) ניתוח נתונים של D5 323-785. F) מודל חרוז של D5 323-785 מבוסס על נתוני SEC ו- G) נתוני IEC. H) כיסוי של דגמי SEC וחברת החשמל. הפנלים ב F) ל H) נוצרו באמצעות תוכנה להדמיה מולקולרית 24. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. פרמטרי נתונים אוספים כלי: ESRF BM29 אורך גל (א) 0.99 q-טווח (א -1) 0,0032 – 0.49 לדוגמא אל גלאי מרחק 2.864 מ ' זמן חשיפה (sec) 1 לכל מסגרת טווח הריכוז נה טמפרטורה (K) 293 גַלַאִי פילאטוס 1M (Dectris) Flux (פוטונים / s) 1 × 10 12 Beam גודל (מיקרומטר 2) 700 × 700 פרמטרים מבניים עבור D5 323-785, SEC I 0 (-1 ס"מ) [מן Guinier] .0237 Rg (א) [מן Guinier] 48 q דקות g R – q מקסימום R g המשמש Guinier 0.77 – 1.24 D מקס (א) [מ- p (r)] 145 q-טווח המשמש p (r) (א -1) 0.02 – 0.17 Porod נפח V p (א 3) [מן פיזור] (570 ± 5) × 10 3 R מסה M מולקולרית (KDA) [מ V p] 345 מחושב monomeric מר מתוך רצף (KDA) 321 פרמטרים מבניים עבור D5 323-785, IEC I 0 (-1 ס"מ) [מן Guinier] .386 Rg (א) [מן Guinier] 46.5 ± 0.1 q דקות g R – q מקסימום R g המשמש Guinier 0.44 – 1.29 D מקס (א) [מ- p (r)] 120 q-טווח המשמש p (r) (א -1) 0.03 – 0.18 נפח V p Porod (& #197; 3) [מן הפיזור] (577 ± 5) × 10 3 R מסה M מולקולרית (KDA) [מ V p] 339 מחושב hexameric מר מתוך רצף (KDA) 321 טבלה 1: פרמטרי נתוני SAXS. הטבלה מסכמת את הפרמטרים של רכישת נתונים SAXS וניתוח.

Discussion

לקבלת מקרומולקולות רבות, צעד טיהור סופי באמצעות כרומטוגרפיה נדרש לפני איסוף נתוני SAXS להשיג ערכת נתונים באיכות טובה. עם זאת, לא כל הדגימות להישאר יציבות; הם עשויים להיות מועדים צבירה או מחדש איזון כדי תערובת של מדינות oligomerization. לכן, צעד טיהור באינטרנט סופי על beamline נדרש לצמצם את הזמן בין הטיהור ואיסוף נתונים על מנת לקבל את נתוני SAXS הטוב ביותר באיכות. בהתאם מאפייני biophysical של החלבון של עניין, SEC-SAXS או IEC-SAXS יכול להיבחר להשיג איכות המדגם אופטימלי. כאן, על מבנה חלבון נגזר helicase / primase D5, שתי הטכניקות מוסברות דנו.

רכישת נתוני SEC-SAXS אהיה יותר ויותר סטנדרטית נגישה beamlines BioSAXS רב. ניתוח נתונים, במיוחד רקע חיסור, הוא יחסית פשוט וקל. עם זאת, אות חיץ יציבהוההפרדה מספיק של מיני macromolecular נשארת חיונית. לכן, חשוב להזמין מספיק זמן כדי לאזן את העמודה ביסודיות. אי של שיטה זו יכולה להיות עקב מזהמים מתמשכים בסדר גודל דומה לחלבון של עניין, בריכוזים נמוכים, או מאגר רגיש-קרינה.

בפועל, בתחילה, SEC-SAXS עשויה לשמש שיטת הבחירה של רוב הדגימות macromolecular. ובכל זאת, פרוטוקולי טיהור רבים דורשים צעד IEC לפני בשל נוכחותם של מזהמים או צבירה. בהינתן שכל צעד ריכוז כרומטוגרפיה קשור פסדים של מדגם (המוערך בכ 30-50%) וזמן, IEC-SAXS הישיר הוא יתרון. לקבלת דוגמיות כי לא יכול להיות מטוהרת על ידי ה- SEC, יהיה זה בשל נוכחותם של בגודל הדומה "מזהמים" או משום שהם המצרפי קשים בריכוזים הצורכים, IEC-SAXS תמיד יהיה הגישה הטובה יותר מתאימה. כמו כן, הספיקה הגבוהה נתמכתבעיני רבים עמודות IEC יכול לעזור להפחית את זמן המעבר בין טיהור ומדידה. בדוגמא המוצגת כאן, IEC שמש עם elution צעד, המאפשר הפרדה של הפסגות הקרובות של D5 323-785 מפני מזהמים בקפידה על ידי בחירת הצעדים ריכוז מלח. באופן עקרוני, את מספר הצעדים הוא בלתי מוגבל, אבל באופן מעשי, לפחות 1 צעד לכל שיא נדרש, ולא יותר מדי צריך להיבחר. לקבלת שיטת חיסור רקע המתוארת לעיל, חשוב לאמוד את מספר גבוה יחסי של יצירות חיץ שונות כדי למצוא את אחד התואם.

חסרון משותף של שני הטכניקות הוא חוסר מידע ריכוז חלבון מדויק. בגלל זה, קביעת המסה המדויקת מבוסס על פיזור קדימה אינה אפשרית. עבור חלבונים כדוריים כגון D5 323-785, היקף Porod מספק אלטרנטיבה, אם כי הערכה מדויקת, המוני פחות, אבל עבור חלבונים גמישים או מופרעים מאודגישה, זה לא תהיה תקפה.

וריאציה של שיטת IEC-SAXS שיפוע צעד חכם המוצגת כאן היא השימוש שיפוע ליניארית במקום. למרות זאת, ניתן לעבוד עם כצעדים רבים ככל רצוי לבודדים-פסגות תת באמצעות elution צעד חכם, בגישת השיפוע ליניארית, היא נדרשת כדי לייעל את תנאי השיפוע בקפידה על מנת להפריד בין הפסגות לחלוטין לפני תחילת SAXS לְנַסוֹת. רקע חיסור בגישה זו יכול להיעשות מסגרת-חכם יכול להיות מאומת על ידי ההשוואה של המסגרות הנפרדות, אבל זה דורש טיפול נתונים מתקדם יותר, וכן תוכנה ייעודית אינה קיימת עדיין.

הבחירה של טור מתאים הוא קריטי עבור שתי הטכניקות, כפי שהוא קובע את הפרדת המינים macromolecular. גודל הדרת עמודות נבדלות קיבולת טעינה, בטווח הגודל של מקרומולקולות להפרדה, ופתרון, תוך עמודות חילוף יונים להשתנות מן הסוג ואת הצפיפותשל החיובים המשותקים שלהם.

בעוד הפרוטוקול המובא כאן הוא ספציפי beamline ESRF BM29, הסתגלות לכל beamline SAXS השני הוא, באופן עקרוני, פשוט. הדרישות העיקריות הן שטף רנטגן גבוה מספיק וגלאי מתאים (רצוי פוטון יחידה-יד נטויה), לרכוש נתוני אות לרעש סבירים בטווח של שניות או פחות, ומערכת כרומטוגרפיה נוזלית מקוונת מסוגל לייצר הדרגתי. היישום המדויק היה, כמובן, תלוי בסביבת beamline המקומית.

התוצאות שהתקבלו על D5 323-785 באמצעות שתי שיטות שונות במקצת. הרדיוס של הסתובבות הוא מעט קטן עבור נתוני IEC מאשר נתוני SEC, ואת והמינימום המקומי של עקומת הפיזור מועבר וקטורי פיזור מעט גדולים. משמעות הדבר היא כי D5 323-785 נמדד עם IEC-SAXS הוא מעט יותר קומפקטי מאשר D5 323-785 נמדד עם SEC-SAXS. זה עלול bדואר בשל הבדלי הכנת המדגם, בזמן בין הטיהור ומדידה (IEC הוא מהיר יותר), או, פחות סבירים, כדי מזהם במדגם המטוהר SEC. המודלים החרוזים שהושגו באופן עצמאי לחלוטין עם שני השיטות ניתן להשוואה (איור 1H). D5 323-785 מציג את המבנה החלול, hexameric הצפוי 18.

לסיכום, חילופי יונים מקוונים כרומטוגרפיה בגודל הדרה באינטרנט שיטות טיהור ביוכימיים חשובים שיכולים להיות מצמידים ישירות SAXS 6,7,9-12,25,26. חיסור רקע נתוני IEC-SAXS הוא מעט יותר קשה ומעורפלת מאשר SEC-SAXS, אבל זה בכל זאת אפשרי. בהתאם מאפייני biophysical של החלבון של עניין, הן SEC ו- IEC-SAXS לאפשר אופטימיזציה של הפרדת מינים עם יתרונות גלומים. מתן שצעדי האימות (כמתואר) הם נצפו כראוי, את הנתונים המתקבלים שנינות ניתן לנתחאמון h, ומודלים ניתן לקבוע באמצעות הכלים הסטנדרטיים הזמינים בתוך הקהילה. יחד, הן טכניקות לאפשר הפרדה באינטרנט עבור מגוון רחב של מקרומולקולות ביולוגיות, מניב נתונים לא נגיש באמצעות מדידות סטטיות רגילות.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Santé des Armées and the Délégation Générale pour l’Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

Materials

1,4 dithiothreitol [DTT] Euromedex EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel Biorad 4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix ThermoFisher scientific F 548
acetic acid glacial VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20104.298
Agarose D-5 Euromedex LF45130653
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K Millipore Ltd UFC903024
Ampicillin sodium salt Euromedex EU0400-D
Benzonase Novagene 70750-3
bromophenol blue  MERCK 8122
Complete protease inhibitor cocktail  Roche 11231400
Econo-Pac 10 DG Desalting column Bio-rad 732-2010
EDTA Sigma E-5134
Glycerol VWR Chemicals (BDH Prolabo) 24388.295
Glycine Euromedex 26-128-6405-C
HindIII Roche 656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel Sigma H0537
Hydrochloric acid (HCl) VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20252.295
Imidazole AppliChem Panreac A1073,0500
InstantBlue Expedeon ISB1L
LB broth Miller Fluka Analytical L3152
MgCl2 ICN Biomedicals Inc. 191421
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
NcoI Fermentas ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)  ThermoFisher scientific C6010-03
pProEx HTb vector  Addgene 10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106
QIAquick Gel extraction kit QIAGEN 28706
QIAquick PCR purification kid QIAGEN 28106
SDS  Sigma 75746
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen life technology S33102
T4 ligase ThermoFisher scientific EL0011
TEV home made
TOP 10 Invitrogen life technology C404003 
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Uno Q 1R column  Bio-rad 720 0011
β-mercaptoethanol MPBiomedicals, LLC 194834
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
Camserver software Dectris n.a. detector control software
DAMAVER ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to align ab initio models 
DAMMIF ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html ab initio  model reconstruction programm
HPLC program Biologic Duo Flow Bio-rad
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program, which performs the manipulation with experimental SAXS
PyMOL DeLano Scientific LLC https://www.pymol.org/ software for visualization.
SUPCOMB ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to superimpose 3D structures
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow Biorad
BioLogic Biofrac Fraction collector Biorad
HPLC system Shimadzu
Labsonic P Sartorius Stedim biotech BBI8535108
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Graewert, M. A., Svergun, D. I. Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS). Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).
  2. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Sci. 19, 642-657 (2010).
  3. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).
  4. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  5. Vestergaard, B. Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions – Small-angle X-ray scattering to the rescue. Arch. Biochem. Biophys. , (2016).
  6. David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).
  7. Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Sci. Rep. 5, (2015).
  8. Lambright, D., et al. Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS. ACA Trans. , 1-12 (2013).
  9. Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins. J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).
  10. Round, A., et al. Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).
  11. Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).
  12. Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering. Acta Cryst. , (2016).
  13. Selkirk, C. Ion-exchange chromatography. Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).
  14. Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).
  15. Pernot, P., et al. Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution. J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).
  16. Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).
  17. Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).
  18. Hutin, S., et al. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. , 4604-4613 (2016).
  19. Round, A., et al. BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).
  20. De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).
  21. Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).
  22. Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).
  23. Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra. Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).
  24. Schrodinger, LLC. . The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).
  25. Jensen, M. H., et al. Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange. J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).
  26. Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes. J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).

Tags

Online Size-exclusion ChromatographyIon-exchange ChromatographySAXS BeamlineStructural BiologySAXSMolar Dispersed SamplesSECGel Filtration BufferHPLC SystemSAXS Flow-through CapillaryRadiation DamageProtein SampleAggregatesHPLC Compatible Glass VialUV Vis Data

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. J. Vis. Exp. (119), e54861, doi:10.3791/54861 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image