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Biochimie

Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

Published: January 05, 2017
doi:
10.3791/54861
, ,
1Structural Biology Group,European Synchrotron Radiation Facility, 2European Molecular Biology Laboratory, 3School of Chemical and Physical Sciences,Keele University, 4Groupe de Microscopie Electronique et Méthodes,Institut de Biologie Structurale

Summary

Die Bestimmung der Lösungsstruktur eines Proteins durch Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS) erfordert monodisperse Proben. Hier stellen wir zwei Möglichkeiten minimalen Verzögerungen zwischen der Probenvorbereitung und Datenerfassung zu gewährleisten: Online-Größenausschluss-Chromatographie (SEC) und Online-Ionenaustauschchromatographie (IEC).

Abstract

Biologische Kleinwinkel-Röntgenstreuung (BioSAXS) ist eine leistungsfähige Technik, die in der Molekular- und Strukturbiologie verwendet, um Lösungsstruktur, Teilchengröße und Form und Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis von Makromolekülen zu bestimmen. Die Technik ist auf eine sehr breite Vielfalt von Bedingungen Lösung einen breiten Bereich von Konzentrationen, pH – Werte, Ionenstärken Spanning, Temperaturen, Zusätze, etc., aber die Probe erforderlich ist , monodisperse sein. Diese Einschränkung führte zur Durchführung der Flüssigkeitschromatographie-Systeme auf SAXS Strahlrohre. Hier beschreiben wir die stromaufwärtige Integration der Größenausschluss (SEC) und Ionenaustauschchromatographie (IEC) an einem Beamline, verschiedene Methoden zur optimalen Hintergrundsubtraktion und Datenreduktion. Als Beispiel beschreiben wir, wie wir sec- und IEC-SAXS auf einem Fragment des Vaccinia-Virus essentiellen Protein D5 verwenden, bestehend aus einem D5N Helicase-Domäne. Wir bestimmen seine Gesamtform und Molekulargewicht, die hexameren Struktur th zeigte Protein.

Introduction

BioSAXS ist ein leistungsfähiges Werkzeug , um die Form von Nanogröße Objekte 1-4 zu bestimmen. Die Streuung von Röntgenstrahlen durch eine Lösung von Makromolekülen, Größe im nm-Bereich enthält, wird bei sehr niedrigen Winkeln aufgezeichnet. Dieser Winkelbereich enthält Informationen über die globalen Parameter: der Gyrationsradius; die größte Intrapartikelporositäten Abstand; die Partikelform; und der Grad der Faltung, Denaturierung oder einer Störung. Die Technik keine Kristalle erforderlich ist , und das Makromolekül in Lösung bleibt und damit unter Bedingungen nachahmt bestimmte wichtige Parameter der Zelle, wie Ionenstärke, pH, usw. Die Kenntnis dieser Faktoren gehalten werden kann , könnte helfen , zu bestimmen, zum Beispiel, die physiologisch relevanten oligomere Zustand eines Proteins von Interesse oder ein vorgeschlagenes Modell eines Komplexes zu validieren. Die Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in verschiedenen Pufferbedingungen, die Schaffung von Modellen von fehlenden Domänen, die Verfeinerung der Homologie-Modelle und die deBeendigung von diskreten gefalteten und entfalteten Zustände können schnell und einfach 5 durchgeführt werden.

Wie bei jeder Technik, hat BioSAXS intrinsische Schwächen: aggregiert oder denaturierte Proben, Mischungen von Partikeln, heterogenen Proben, Strahlenschäden und Puffer Mismatches kann in un-interpretierbaren Daten zur Folge haben. Für viele Analyseverfahren wird implizit angenommen, daß die Probe monodispers ist, eine Anforderung, die oft schwierig in der Praxis zu erhalten. In vielen Fällen ist der Abbau der Probe fein und nicht in den Daten auf ihren eigenen erfasst werden kann, und jeder Versuch, die Daten liefert ungenaue oder sogar irreführende Ergebnisse zu interpretieren. Um diese Hindernisse zu überwinden, die Kombination von Grßenausschlußchromatographie (SEC) und SAXS wurde auf vielen Strahlrohren umgesetzt Datenqualität gewährleisten und diese Technik zugänglicher zu machen für immer schwieriger Proben 6-11. Vor kurzem haben wir eine neue Methode, um das Repertoire durch die Entwicklung von Online-IonenaustauschChromatographie (IEC) -gekoppelten SAXS 12. Beide Techniken eröffnen SAXS auf ein breites Spektrum von biologischen Partikeln früher unmöglich zu analysieren. Die Wahl, welche Methode zu verwenden, hängt von den biophysikalischen Eigenschaften der Partikel von Interesse.

SEC trennt Makromoleküle durch ihre Größe, wodurch mindestens ein 10% iger Unterschied in der scheinbaren molekularen Masse wird für die Trennung benötigt wird. Physikalischen Grenzen der Säule und physiologischen Eigenschaften der Proben, wie hydrophobe Oberflächen, Flexibilität und fehlender Stabilität, komplizieren auch die Datenerfassung, Analyse und Interpretation.

Ionenaustauschchromatographie, die Moleküle basierend auf ihrer Ladung und somit ihre Bindungsaffinität an die IEC-Säule kann trennt, verwendet werden, anstelle von oder zusätzlich zu SEC. Die Gesamtladung kann leicht durch Änderung des pH manipuliert werden, oder durch Variieren der Salzkonzentration des Puffers, ein relativ einfaches Verfahren zur kontrollierten Bereitstellung elution der Moleküle aus der IEC-Säule. Durch die Ladung unter Verwendung der Trennung von ähnlichen Arten und Größen von Molekülen, die sonst schwer zu trennen, kann routinemäßig mit IEC durchgeführt werden. Darüber hinaus hat IEC den Vorteil, mit verdünnten Proben umgehen zu können, so dass man die Konzentration Schritte zu vermeiden, die das potenzielle Risiko der Denaturierung des Proteins führen. Leider, wie die Ladungsverteilung äußerst Probe abhängig ist, erfordert IEC Optimierung hinsichtlich der pH – Wert und die Salzkonzentrationen 13,14.

Für viele Proteine, die schwierig zu exprimieren sind, zu reinigen, oder beide, nur geringe Probenmengen zur Verfügung zu studieren. Es ist wichtig, effizient zu sein und die Anzahl der Reinigungsschritte und somit die Verluste zu minimieren. Aus diesem Grund ist der letzte Reinigungsschritt direkt online vor SAXS Datenerfassung, um die Wahrscheinlichkeit der Erfassung einer guten Datensatzes zu erhöhen.

Hier, Die wir online SEC-SAXS und IEC-SAXS präsentieren und zu vergleichen. Beide Techniken wurden auf der BioSAXS – Strahlrohr BM29 an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble, Frankreich 15 umgesetzt. Als Testfall verwendeten wir das D5N und Helicase-Domäne des Proteins Vacciniavirus D5, die ziemlich schwierig war strukturell mit anderen Verfahren zu analysieren. Das Vaccinia-Virus ist ein Mitglied der Poxviridae Familie und ist zu 98% identisch mit der Variola-Virus, die Ursache der Pocken. Mit dem Vaccinia-System untersuchen wir die Replikationsmaschinerie, die sich hier auf das Wesentliche Helikase-Primase D5.

D5 ist ein 95-kDa – Protein mit einem N-terminalen archeo-eukaryotische Primase (AEP) Bereich 16 durch einen Cystein – Cluster – Region gefolgt (res. 240-345) 16. Weiter in Richtung des C-Terminus kommt eine D5N Domain (Res. 340-460), die immer mit D5-Typ – Helikasen zugeordnet ist, und schließlich ein -Superfamilie 3 (SF3) Helicase – Domäne (Res. 460-785) 17 (Figure 1A). Die Helikasedomäne D5 baut einen hexameren Ringstruktur, die für die enge Bindung an DNA benötigt wird. Dank der jüngsten SAXS und EM – Studien, die niedrig auflösenden Strukturen des Primase und die Helikase – Domänen sind jetzt 18 bekannt.

Hier zeigen wir, wie die implementierten Online-Chromatographie-Techniken auf dem BioSAXS-Strahlrohr zu verwenden BM29 bei ESRF Erkenntnisse zu gewinnen in die Struktur des C-terminalen Fragment (Rest 323-785) von D5.

Protocol

1. Beschreibung der Offline-Vorbereitung und Sample Erzeugung eines D5 Deletion Protein HINWEIS: Die D5 323-785 Konstrukt (1A) wurde kloniert, exprimiert und gereinigt , wie beschrieben 18. Klonen Sie das Konstrukt in die pProEx HTB Vektor Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf D5R der Primer 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 'und 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' verwendet und eine PCR-Reaktionsmischung mit Polymerase, im Anschluss an die Beratung des Herstellers. Reinige die PCR-Fragmente über Spin-Säulen, nach den Anweisungen des Herstellers. Digest Die PCR-Fragmente und das Plasmid mit NcoI und HindIII-Restriktionsenzymen, nach den Empfehlungen des Herstellers für die Pufferzusammensetzung und Inkubationszeit. Laufen die Fragmente auf einem 1% igen Agarosegel in 0,5 × TAE-Puffer (20 mM Tris, 10 mM Essigsäure,und 0,5 mM EDTA) und beflecken das Gel mit einem DNA-Farbstoff. Setzen Sie das Gel mit UV-Licht. Achtung: Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung! Schneiden Sie die Bänder der verdauten PCR-Fragmente und das verdaute Plasmid und reinigen die DNA, die eine Gelreinigung Zentrifugiersäule-Kit nach den Empfehlungen des Herstellers. Ligieren der gereinigten PCR-Fragmente in das Plasmid eine schnelle Ligatur-Kit nach den Empfehlungen des Herstellers. Verwandeln Sie das Produkt von der Ligationsreaktion in kompetente Bakterien über Hitzeschock für Plasmidamplifikation optimiert. Die Hälfte des Ligationsprodukts in ein Fläschchen von Bakterien. Inkubieren Sie die Reaktionsröhrchen auf Eis für 20 min. Inkubieren der Röhrchen bei 42 ° C für 30 s. Das Röhrchen auf Eis für 2 min. 1 ml Luria Bertani (LB) Broth (Miller) ohne Antibiotika und lassen Sie die Zellen für 1 h bei 37 ° C erholen. Spin down die Zellen bei 16.100 xg foR 3 s in einer Tischzentrifuge microtube und entfernen die meisten des Mediums. Verbreiten Sie die Zellen auf eine LB-Agarplatte mit Ampicillin (50 ug / ml final) und lassen Sie die Kolonien über Nacht bei 37 ° C wachsen. Legen Sie eine Kolonie in 3 ml LB mit Ampicillin (50 ug / ml final) und wachsen, um die Kultur bei 37 ° C, über Nacht bei 160 rpm schütteln. Folgen Sie den Anweisungen des Minipräparationskit das Plasmid zu extrahieren. Sende eine Probe des Plasmids für die Sequenzierung und Analyse der Sequenz für die Abwesenheit von Mutationen und für die korrekte Insertion. Verwandeln Sie die pProEx HTB D5 323-785 in Bakterien bauen für die Proteinexpression optimiert (1 & mgr; l verwenden und die Schritte in Schritt 1.1.7 folgen). Verbreiten Sie die Bakterien auf eine LB-Agarplatte mit Ampicillin (50 ug / ml final). Um eine Startkultur schaffen, legte eine Kolonie in 300 ml LB mit Ampicillin (50 ug / ml final) und wachsen die Bakterien bei 37 ° C, bei 160 r SchüttelnUhr über Nacht. Beimpfen von 12 x 1 l LB in Gegenwart von Ampicillin (50 ug / ml final), die jeweils mit 20 ml der pProEx HTB D5 323-785 Bakterienstarterkultur bei 37 ° C , bis eine OD 600 = 0,3 erreicht ist . Reduzieren Sie die Temperatur auf 18 ° C und induzieren Ausdruck bei einer OD 600 = 0,5 mit 1 mM IPTG. Inkubieren der Kulturen, sie bei 160 Umdrehungen pro Minute und 18 ° C über Nacht schütteln. Ernte der Bakterien durch Zentrifugation bei 50.000 xg und bei 4 ° C für 30 min. Resuspendieren der Bakterienpellets in etwa 150 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 10 mM β-Mercaptoethanol und 10% Glycerol) mit 1x – Protease – Inhibitor und 25 Einheiten ( U) / 10 ml DNase. Lyse die Bakterien über Beschallung auf Eis (1-Zoll-Sonde, die 50% Energie, 0,5 s Impuls, 0,5 s Pause, 3x 5 min). Laden Sie den Überstand auf eine Nickel-Affinitätssäule (Ni-Säule, 1,5 ml Bettvolumen) und waschen Sie es mit 10 Säulenvolumina (CV) von binding Puffer (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol und 10% Glycerin), 10 CV Waschpuffer (50 mM Tris-HCl [pH 7], 1 M NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol und 10% Glycerin) und 10 CV Wasch Imidazol (50 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin und 30 mM Imidazol). Eluieren die D5 323-785 (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin und 200 mM Imidazol). Untersuchen Sie die verschiedenen Reinigungsschritte über Natriumdodecylsulfat (SDS) Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Last 2-20 ul jeder Reinigungsschritt Durchfluss gemischt mit 1x loading dye (2x: 4% SDS, 20% Glycerin, 120 mM Tris-HCl [pH 6,8] und 0,02% Gewicht / Volumen Bromphenolblau) auf einem 10 % SDS-Gel und sie bei 200 V in 1x Laemmli Laufpuffer (25 mM Tris, 0,192 M Glycin und 0,1% SDS) ausgeführt wird. Stain das Gel mit einem ready-to-use Coomassieblau-Lösung. Exchange der Puffer des eluierten Proteins mit Bindungspuffer eine Entsalzungssäule unter Verwendung gemäß der Anleitung des Herstellers. Cleave das His-Tag durch Kernaufnahme-a – Endopeptidase (TEV, 1 mg / 100 mg Protein) zur Proteinlösung Tabakätzvirus hinzufügen. über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Überprüfen Sie die Verdauung durch SDS-PAGE (siehe Schritt 1.5) durchführen Äquilibrieren der Ni-Säule in Bindungspuffer. Lassen Sie die Proteinlösung durch und Waschen der Kügelchen mit 2 CV von Imidazol Waschpuffer passieren, während die Durchfluss zu sammeln. Konzentriere das Protein eine Zentrifugalkonzentrator auf ein Endvolumen von 0,5 ml verwendet wird. Injizieren der konzentrierten Protein auf eine Größenausschluss-Säule, die mit Gelfiltration Puffer äquilibriert (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% Glycerin und 1 mM Dithiothreitol [DTT]). Sammeln Sie die Durchfluss in 0,5-ml-Fraktionen. Überprüfen des Vorhandenseins und Reinheit des Proteins in den Proben durch peakSDS-PAGE durchführen (siehe Schritt 1.5). Kombinieren Sie die Fraktionen des eluierten Spitze von D5 323-785. Verdünne die Probe auf 25 mM NaCl und 5% Glycerin während die Tris und DTT-Konzentrationen konstant zu halten (für 5 ml Proteinlösung in 20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 10% Glycerin und 1 mM DTT, hinzufügen ersten 5 ml 20 mM Tris-HCl [pH 7] und 1 mM DTT, und füge dann 20 ml 20 mM Tris-HCl [pH 7], 5% Glycerin und 1 mM DTT). Laden der Probe auf eine Ionenaustauschsäule. Nutzungspuffer A (20 mM Tris [pH 7], 25 mM NaCl, 5% Glycerin und 1 mM DTT) und Puffer B (20 mM Tris [pH 7], 1 M NaCl, 5% Glycerin und 1 mM DTT) zu bilden M. eines Salzgradienten von 25 mM bis 1 Sammeln Sie das eluierte Protein in 1,5-ml-Fraktionen. Überprüfen des Vorhandenseins und Reinheit des Proteins in den Peak – Proben durch SDS-PAGE durchführt (siehe Schritt 1.5 und 1B) Aufkonzentrierung der Proteinlösung in einer Zentrifugal-Konzentrator auf ein Endvolumen von 0,5 mL. rerun die konzentrierte Protein auf einer Größenausschlusssäule in Gel-Filtrationspuffer (20 mM Tris-HCl [pH 7], 150 mM NaCl, 5% Glycerin und 1 mM DTT; siehe Schritt 1.11). 2. Datenerfassung HINWEIS: Anfrage Strahlzeit so früh wie möglich. Für ESRF, Richtlinien zur Verfügung Zugriffstypen und wie einen Antrag einzureichen sind zu finden unter: http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Nach der Annahme des Vorschlags und eine Einladung für das Experiment, haben alle Teilnehmer ein Sicherheitstraining zu absolvieren. Nach der Validierung der Ausbildung, füllen Sie das "A-Form" (über das ESRF-User-Portal), die die Forscher für das Experiment, zusammen mit dem erforderlichen Sicherheits Informationen zu den Proben den Besuch der beamline zu erklären. Kontaktieren Sie die Ansprechpartner vor Ort, um das Experiment zu diskutieren. SEC-SAXS Datensammlung HINWEIS: Für online Reinigung, verwenden Sie die Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) -System bei BM29 installiert. Das System besteht aus einem in-line Entgaser, einer binären Pumpe, ein Ventil für den Pufferauswahl und Gradienten, einem Autosampler, einem UV-VIS-Array Photospektrometer und einem Konduktometer. Es ist direkt mit dem Durchfluss Kapillare der Einheit 19 SAXS Belichtung angebracht. Geben Sie 1 ml der Gelfiltrationspuffer beiseite. Schließen Sie die Pufferflasche mit dem SEC-System (Standard ist Port A). Wählen Sie die Durchflussrate in der Säule im Einsatz abhängig. Hinweis: Für die Größenausschluss-Säule verwendet hier die Fließgeschwindigkeit 0,1 ml / min ist. Definieren Sie den maximalen Druck für die Spalte, nehmen die Gegendruck, und stellen Sie die Erfassungszeit auf mindestens 1,2 CV. Spülen Sie die Pumpen und die Upstream-Rohre über die "Auto-Purge" -Funktion. Warten Sie, bis das System mit dem Puffer und schließen Sie die Spalte gefüllt ist. Äquilibrieren der Säule um mindestens 1,5 CV vorbei. ineinander greifendie Stalles und messen den eingestellten Puffer zur Seite in Schritt 2.1.1, den Probenwechsler zur Variation des Signals zu steuern wegen Strahlenschäden. Nur dann weiter, wenn es keine Strahlungsschäden an den Puffer ist. Schalten Sie das beamline Steuersystem HPLC-Modus. Machen Sie einen Testlauf des Puffers, sammeln 200 Frames mit 1 s pro Frame. Schreiben Sie die Anzahl der Zählungen durch den Detektor in der summierte Intensität Plot gegeben unten. HINWEIS: Das Signal sollte den zuvor gemessenen Puffer übereinstimmt, und die summierte Intensität über die Zeit konstant bleiben sollte. Wenn das Signal nicht oder entspricht nicht konstant ist, eine längere Äquilibrierung des Systems erforderlich ist. Spin down die Probe bei 13.000 × g in einer Tischzentrifuge microtube für mindestens 10 min. Füllen Sie die Probe in eine HPLC-kompatiblen Glasfläschchen (mitgeliefert) und legte sie in die Auto-Injektor. Notieren Sie sich die gut Position. Interlock die experimentelle Stalles unter Verwendung von Standardverfahren, wie in der Benutzer-Sicherheitstraining erläutert. Melden Sie sich und einen Ordner für die Datenspeicherung durch die beamline Steuersoftware erstellen. Programmieren Sie das HPLC-System der "Quick Charge" -Funktion verwenden. Stellen Sie den Speicherort für die UV-Daten zu dem Ordner, in Schritt 2.1.10 erstellt. Achten Sie darauf, die automatische ASCII Umwandlung der UV-Daten, die Speicherung der ASCII-Datei in denselben Ordner zu aktivieren. Wählen Sie das Injektionsvolumen und auch Position. Fügen Sie die Messung durch Drücken der Schaltfläche "Start" in die Warteschlange. Die Software fragt den Stapel zu speichern. Bereiten Sie für das Speichern, aber nicht drücken Sie die Schaltfläche "Speichern", da dies die Messung automatisch gestartet wird. Richten Sie die Datenerfassung Parameter in der Steuerungssoftware-Strahlrohr. Wählen Sie die Anzahl von Rahmen, so dass die Gesamtdatenerfassungszeit in geringem Überschuß der Erfassungszeit in Schritt 2.1.2 definiert ist. Öffnen Sie den Sicherheitsverschluss und starten SAXS Datenerfassung mit der beamline Steuerungssoftware. Stellen Sie sicher, dass die Daten correkt erworben. Vergleichen Sie die neu gesammelten Daten zu den in Schritt gesammelten Daten 2.1.6 und prüfen, ob die Anzahl der Zählungen in der summierte Intensität für mindestens 100 Frames konstant bleibt und entspricht dem Wert aus Schritt 2.1.6. Starten Sie die SEC durch Drücken der Schaltfläche "Speichern" laufen, wie in Schritt 2.1.11 vorbereitet, und notieren Sie die Rahmennummer in der CamServer Software angezeigt, wenn die Injektion abgeschlossen ist und UV-Datenerfassung beginnt. Nach der Datensammlung, öffnen Sie die ISPyB Datenbank 20 bei Öffnen Sie die "Datenerfassung" , und drücken Sie die Schaltfläche "Go" den Datensatz für den Zugriff auf und die Ergebnisse der automatischen Analyse 21. IEC-SAXS Datenerfassung HINWEIS: Anstelle des kontinuierlichen linearen Gradienten üblicherweise in IEC Experimenten angewendet, mit einem stufenweisen Gradienten in dem die Menge an Puffer B in voreingestellten diskreten Schritten erhöht wird. Erstellen Sie das HPLC-Programm für eine samplE-freien Puffer laufen. Programmieren eines stufenweisen Gradienten ausgehend von 0% Puffer B und die Erhöhung um 5 Prozentpunkte nach zwei CV bis 100% Puffer B erreicht ist. Auf die Seite legen einige von jedem Puffer. Schließen Sie die Flasche mit dem salzarmen Puffer A bis Port A und den mit dem Hochsalzpuffer B nach B. Wählen der Strömungsrate und bleiben unterhalb der Druckgrenze der Säule (in diesem Beispiel 1 mL / min). Wie in Schritt 2.1.3, spülen Sie die Pumpen und Upstream-Schlauch durch die "Auto-Löschen" -Funktion. Äquilibrieren das System in salzarmen Puffer A (siehe Schritt 1.15) und schließen Sie das Ionenaustauschsäule. Warten Sie, bis die Säule vollständig ins Gleichgewicht gebracht wird (mindestens 1,5 CV). mit dem Probenwechsler, wie in Schritt 2.1.5 Verwenden Sie den Puffer beiseite legen in Schritt 2.2.2 Puffer A und B für Strahlenschäden untersuchen. Überprüfen der Puffer aus der Säule kommt, wie in Schritt 2.1.6. Vergleichen des Signals an den Signal Puffer A in Schritt 2.2.6 aufgezeichnet. Beachten Sie wieder dieAnzahl der Zählungen in der Intensität Plot summiert. Erstellen Sie einen Ordner für die Datenspeicherung für den Puffer laufen. Richten Sie die Datenerfassung in die HPLC-System-Modus. Wählen Sie die Anzahl von Rahmen, so dass die Gesamtdatenerfassungszeit, die über die Gesamtzeit der IEC Lauf ist (siehe Schritt 2.2.1). Öffnen Sie den Sicherheitsverschluss und starten Sie die SAXS Datenerfassung. Stellen Sie sicher, dass es auf den Wert festgestellt in Schritt 2.2.7 für mindestens 100 Bilder richtig und überprüfen, dass die summierte Intensität bleibt konstant verläuft. Verwenden Sie die "Single Run" Merkmal der HPLC-Software und starten Sie den stufenweisen Gradienten programmiert in Schritt 2.2.1. Für die Injektion, stellen Sie die Fläschchen Nummer auf -1, um keine Probe in diesem Schritt zu injizieren. Schreiben Sie die Anzahl der Frames erworbenen sich wie das Programm startet. Erstellen Sie das HPLC-Programm für den Probelauf. Programmieren eines stufenweisen Gradienten von 0% B. Estimate Puffer der Prozentsatz des Puffers B in jedem offline in Schritt gemessenen Spitzenausgangs 1.1.5 ( <strOng> Abbildung 1B). Setzen Sie mindestens 3 Schritte genau 1 Prozentpunkt unter und 1,5 Punkte über den Gipfeln von Interesse, die jeweils 2,5 CV (1C). Fügen Sie einen letzten Schritt bei 100% Puffer B für 2,5 CV. Spin down die Probe bei 13.000 × g in einer Tischzentrifuge microtube für mindestens 10 min. Verdünnte D5 323-785 in die Salzkonzentration des Puffers A (25 mM) , indem sie sie mit 20 mM Tris-HCl [pH 7], 10% Glycerin und 1 mM DTT gemischt wird . Legen Sie die Probe manuell auf die Säule. Setzen Sie den Puffer ein Eingangsrohr in die verdünnte Probe nach der Pumpen pausiert die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Trennen Sie die Spalte von den Detektoren, um direkt den Durchfluss aus der Kolonne zu sammeln. Wenn der Probenbehälter fast leer ist, kehren die Eingangsrohr in Puffer A (wieder die Pumpen angehalten, während der Schlauch zu bewegen) und das Pumpen mit Puffer A starten Sie die Probe aus dem Schlauch auf die Säule zu übertragen. Sobald die gesamte Probe wurdegeladen, 2 CV Puffer A passieren, und dann die Spalte mit den Detektoren wieder an. Für den Probelauf, um einen Ordner für die Datenspeicherung erstellen. Öffnen Sie den Sicherheitsverschluss und starten Sie die SAXS Datenerfassung. Stellen Sie sicher, dass die Datenerfassung auf dem notierten Wert in Schritt 2.2.7 für mindestens 100 Bilder richtig und überprüfen, dass die summierte Intensität bleibt konstant verläuft. Verwenden Sie die "Single Run" Merkmal der HPLC-Software, um die schrittweise Gradienten in Schritt 2.2.12 programmiert zu starten. Für die Injektion, stellen Sie die Fläschchen Nummer auf -1, um keine Probe in diesem Schritt zu injizieren. Schreiben Sie die Anzahl der Frames erworbenen sich wie das Programm startet. Open "Datenerfassung" in ISPyB 20 ein und drücken Sie auf "Go" auf den Datensatz zu suchen und die automatische Analyse 21. Exportieren Sie die UV-Daten aus dem HPLC-System in ASCII-Format über die "Nachlauf-Analyse" Software. 3.SEC-SAXS Datenreduktion und Analyse Öffnen Sie die Daten in der Datenerfassung in ISPyB durch die "Go" -Taste drücken. Bestimmen Sie in der Übersicht, die der SAXS Datenerfassungsrahmen entsprechen dem Elutionspeak. Stellen Sie sicher, dass der Radius der Kreisbewegung im gesamten peak stabil ist. Bestätigen Sie, dass die automatisierte Puffer Korrektur korrekt durchgeführt wurde. Lastrahmen aus dem zentralen Teil des Peaks in einem Programm , das Manipulationen mit experimentellen SAXS Daten durchführt Dateien 22 und sie mitteln. Dann laden Sie den automatisch generierten Pufferdatei und überprüfen , ob die hohen q Regionen der gemittelten Frames und dem Pufferrahmen übereinstimmen. Vergleichen Sie die in der gesamten Spitze erworben Rahmen quantitativ die CORMAP Test mit 23. Laden Sie die automatisch erstellt Subtraktionen (* _sub.dat-Dateien) von Rahmen für den Bereich von Interesse. Skalieren Sie sie miteinander durch die "Scale" Taste drücken. ComparE ihnen die "Datenvergleich" Funktion. Es sollte in der gesamten Spitze zwischen den Rahmen keine systematischen Veränderungen geben. Öffnen Sie alle * -_ sub.dat Rahmen von Interesse, kombiniere sie mit der "Merge" -Taste, und speichern Sie die zusammengefügte Datei in .dat-Format. Bestimmen Sie den Radius der Kreisbewegung mit dem "Radius von Gyration" Werkzeug im Programm, den ersten Datenpunkt in der Guinier Bereich für die spätere Zuschneiden der Daten mit niedriger Auflösung der Feststellung. Bestimmen Sie die Paar-Abstand Verteilungsfunktion mit der "Entfernung Distribution" Werkzeug im Programm und speichern Sie die resultierende .out-Datei als gnom.out. 4. Ab – initio – Modellierung Ein 40 x Ab – initio – Modellrekonstruktion Programm ohne Symmetrie Einschränkungen Auf einer Maschine Unix laufen. Erstellen Sie einen neuen Ordner und kopieren Sie die Datei gnom.out zu. Führen Sie das Programm wie folgt: für ((i = 1; i <= 40; i ++)); tun dammif gnom.out -ms -p dammifp1_ $ i; deins Analog dazu eine Ab – initio – Modell Wiederaufbauprogramm mit Symmetrie Einschränkungen für sechsfache Symmetrie in einem zweiten Ordner ausführen: für ((i = 1; i <= 40; i ++)); do dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ i; erledigt Richten Sie alle Ab – initio – Modellrekonstruktion Programm Ausgabedateien (* -1.pdb). In den beiden Ordnern aus den Schritten 4.1 und 4.2 laufen damaver -a * -1.pdb. Öffnen Sie die Vereinigung aller Modelle (damaver.pdb) sowie das Modell auf die richtige Lautstärke (damfilt.pdb) gefiltert in einer geeigneten molekularen Visualisierungssoftware 26 und vergleichen sie. Öffnen Sie die damsel.log-Datei in einem Texteditor. Das Modell als "Referenz", die an der Unterseite der Datei ist das repräsentativste Modell. 5. IEC-SAXS Datenreduktion, Analyse und Modellierung In dem Programm , das die Manipulation mit experimentellen SAXS Datendateien 22, laden etwa 50 SAXS – Rahmen aus jedem Mischschritt führt vonder Puffer laufen, drücken Sie die "Average" Taste, und die Ergebnisse speichern. Auf der Grundlage der automatischen Verarbeitungsergebnisse über ISPyB vorhanden, zu identifizieren, welche der Experimentierrahmen entsprechen der Elution des Proteins und überprüfen, ob der (vorläufig) Gyrationsradius ganzen peak stabil ist. Legen Sie die Rahmen in die experimentelle SAXS Datendateien Bearbeitungsprogramm 22 und im Durchschnitt sie, wie für die Pufferrahmen durchgeführt (siehe Schritt 5.1). Dann laden Sie die Puffer – Dateien erzeugt in Schritt 5.1 und vergleichen Sie die hohe q Regionen (über 4,2 nm -1) , einen Puffer zu finden, die den Durchschnitt von der Spitze übereinstimmt. HINWEIS: Es sollte zwischen dem Mittelwert aus der Spitze und der Puffer-Offset nicht systematisch sein. Wenn die Probe Kurve zwischen zwei Pufferkurven zu fallen scheint, interpoliert ihre Kurven durch den Mittelwert zu berechnen. Ziehen Sie den Puffer als das beste Spiel aus der mittleren Streukurve der Peakfraktion identifiziert und speichern Sie die resultierende subtrhandelten Datei. Darüber hinaus schaffen subtrahiertem Kurven, die die durchschnittliche Pufferkurven aus den vorangehenden und nachfolgenden Mischschritte unter Verwendung der Fehlermarge der Subtraktion zu schätzen. Wiederholen Sie die Schritte 5.3 und 5.4 einzeln für die linken und rechten Hälften der Spitzenwert und vergleichen die Ergebnisse mit denen von Schritt 5.4 für die Stabilität des Signals in der gesamten Spitze zu überprüfen. Führen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 für alle drei Kurven subtrahiert aus Schritt 5.4. Vergleichen der Ergebnisse für alle drei Kurven subtrahiert. Hinweis: Nur Ergebnisse, die innerhalb der Fehlermarge der Subtraktion robust bleiben vertraut werden kann. Führen Modellierung wie in 4.1 und 4.2 für die beste Subtraktion in Schritt 5.3 identifiziert Schritte. Folgen 4.3 bis 4.5 Schritt, um die Modelle auszurichten und den repräsentativsten zu identifizieren. 6. Vergleich der Ergebnisse Führen Sie ein Programm zu 3D – Strukturen 12 auf den repräsentativen Modellen der SEC (Schritt 4.5) ein superimposed IEC-SAXS-Daten (Schritt 5.9) mit P6 Symmetrie: supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb Importieren Sie die model_sec.pdb und die model_iec-r.pdb in einem molekularen Visualisierungssoftware. Öffnen Sie die .fir Dateien des modelsec.pdb und die modeliec-r.pdb in einer Tabelle und erstellen Sie ein 2D-Diagramm von experimentellen und berechneten Streukurven.

Representative Results

Die Ergebnisse des modellfreien invariant Analyse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Analyse der D5 323-785 SEC-SAXS – Daten mit einer Molekularmasse Schätzung zeigte (aus einer Analyse Porod) von 345 kDa im Vergleich zu 338 kDa beobachtet IEC-SAXS verwenden. Beide sind in Übereinstimmung mit dem erwarteten Masse von 6 mal 53,5 kDa (321 kDa) für ein Hexamer. (: Χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: SEC-SAXS χ 2 = 3,1) Die ab initio Modellierung beider Datensätze wurde ohne auferlegten Symmetrie unternommen und unter Verwendung von C6 Symmetrie (SEC-SAXS: χ 2 = 1,0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Da die Gesamt Anpassungen an die Streudaten für beide Rekonstruktionen in beiden Fällen vergleichbar sind (1D und E) können C6 Symmetrie angenommen werden. Somit entspricht das Modell zu einer hexagonalen kegelförmige Struktur mit einem zentralen Kanal, der teilweise versperrten (SEC scheint: 1F; IEC: <strOng> 1G, Overlay Abbildung 1H). Eine Prüfung der einzelnen Modelle vor der Mittelung zeigt, dass dieses Hindernis wahrscheinlich ein Artefakt des Mittelungsprozesses. Abbildung 1: SAXS Datenanalyse und der Vergleich von D5 323 -785 (Figur aus References angepaßt 12 und 18). A) Schematische Domänenstruktur von D5 Protein und D5 323-785. B) Offline Ionenaustausch – Chromatogramm mit der Angabe der drei Spitzen. Orange Kurve: Die Absorption bei 280 nm (au), blaue Kurve: Anzahl von Puffer B Prozentuale Anteile der Puffer B an den Spitzen sind angegeben. C) Online – Ionenaustausch – Chromatogramm. Farbschlüssel wie in B. Zusätzlich wird die gemessene Intensität wird in grün angezeigt. Die experimentelle Streukurve einnd berechnete Kurve des Modells erhalten durch SEC-SAXS D) und IEC E) Datenanalyse von D5 323-785. F) Bead Modell D5 323-785 basierend auf dem SEC – Daten und G) IEC – Daten. H) Overlay der SEC und dem IEC – Modelle. Die Platten in F) bis H) wurden unter Verwendung eines molekularen Visualisierungssoftware 24 angelegt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Datenerfassungsparameter Instrument: ESRF BM29 Wellenlänge (Å) 0,99 q-Bereich (Å -1) ,0032-,49 Probe-Detektor-Abstand 2.864 m Die Belichtungszeit (sec) 1 pro Rahmen Konzentrationsbereich n / a Temperatur (K) 293 Detektor Pilatus 1M (Dectris) Flux (Photonen / s) 1 × 10 12 Strahlgröße (& mgr; m 2) 700 × 700 Strukturparameter für D5 323-785, SEC I 0 (cm -1) [von Guinier] 0,0237 Rg (Å) [von Guinier] 48 q min R g – q g max R für Guinier verwendet 0,77-1,24 D max (Å) [von p (r)] 145 q-Bereich verwendet , für p (r) (Å -1) 0,02-0,17 Porod Volumen V p (A 3) [von Scatter] (570 ± 5) × 10 3 Molekularmasse M r (kDa) [von V p] 345 Berechnete monomeren Herr von Sequenz (kDa) 321 Strukturparameter für D5 323-785, IEC I 0 (cm -1) [von Guinier] 0,386 Rg (Å) [von Guinier] 46,5 ± 0,1 q min R g – q g max R für Guinier verwendet 0,44-1,29 D max (Å) [von p (r)] 120 q-Bereich verwendet , für p (r) (Å -1) 0,03-0,18 Porod Volumen V p (& #197; 3) [von Scatter] (577 ± 5) × 10 3 Molekularmasse M r (kDa) [von V p] 339 Berechnete hexameren Herr von Sequenz (kDa) 321 Tabelle 1: SAXS Datenparameter. Die Tabelle fasst die Parameter der SAXS Datenerfassung und Analyse.

Discussion

Für viele Makromolekülen unter Verwendung von Chromatographie eine abschließende Reinigungsschritt erforderlich ist, bevor zu SAXS Datensammlung eine gute Qualität Datensatz zu erhalten. Allerdings sind nicht alle Proben stabil bleiben; sie können zur Aggregation oder Wieder Äquilibrierung zu einer Mischung aus Oligomerisierung Zustände anfällig. Daher wird eine endgültige Online-Reinigungsschritt auf der Strahllinie erforderlich, um die Zeit zwischen Reinigung und Datenerfassung zu minimieren, um die beste Qualität SAXS Daten zu erhalten. In Abhängigkeit von den biophysikalischen Eigenschaften des Proteins von Interesse, SEC-SAXS oder IEC-SAXS könnte optimale Probenqualität zu erhalten gewählt werden. Hier auf einem Proteinkonstrukt abgeleitet von der Helikase / Primase D5 werden beide Techniken erläutert und diskutiert.

Erwerb von SEC-SAXS-Daten werden immer mehr standardisiert werden und ist auf vielen BioSAXS Strahlrohre. Die Datenanalyse, insbesondere Untergrundsubtraktion, ist relativ einfach und leicht. Jedoch ist ein stabiles Puffersignalund die ausreichende Trennung der makromolekularen Spezies bleibt unerlässlich. Daher ist es wichtig, genug Zeit zu reservieren, die Säule gründlich zu äquilibrieren. Versagen dieser Methode kann wegen persistent Verunreinigungen von ähnlicher Größe zu dem Protein von Interesse, niedrigen Konzentrationen und strahlungsempfindlichen Puffer sein.

In der Praxis wird zunächst ist SEC-SAXS wahrscheinlich als die Methode der Wahl für die meisten hochmolekularen Proben verwendet werden. viele Reinigungsprotokolle erfordern eine vorherige IEC Schritt aufgrund des Vorhandenseins von Verunreinigungen oder Aggregation noch. Da jede Konzentration und Chromatographie-Schritt mit Verlusten von Probe (schätzungsweise 30-50%) zugeordnet ist, und die Zeit ist auch eine direkte IEC-SAXS vorteilhaft. Bei Proben, die nicht durch SEC gereinigt werden, sei es aufgrund der Anwesenheit von ähnlicher Größe "Verunreinigungen" oder weil sie bei den erforderlichen Konzentrationen stark Aggregat, IEC-SAXS würde die besser geeigneten Ansatz immer sein. Auch die höheren Strömungsraten unterstütztdurch viele können IEC Spalten helfen, die Laufzeit zwischen Reinigung und Messung zu reduzieren. In dem hier vorgestellten Beispiel wurde IEC mit einer Stufe Elution verwendet, die durch sorgfältige Auswahl der Salzkonzentration Schritte zur Trennung der Nähe Peaks von D5 323-785 von Verunreinigungen ermöglicht. Im Prinzip ist die Anzahl der Schritte unbegrenzt, praktisch aber mindestens 1 pro Schritt peak erforderlich ist, und nicht zu viele gewählt werden sollte. Für den Hintergrund Subtraktionsverfahren oben beschrieben, ist es wichtig, eine relativ hohe Anzahl von verschiedenen Pufferzusammensetzungen zu messen, um die Anpassung zu finden.

Ein gemeinsamer Nachteil beider Techniken ist der Mangel an präzisen Proteinkonzentration Informationen. Aus diesem Grund, und zwar auf Vorwärtsstreuung basierend Massenbestimmung ist nicht möglich. Für globuläre Proteine wie D5 323-785, bietet das Porod Volumen eine Alternative, wenn auch weniger präzise, Massenschätzung, sondern auch für hochflexible oder ungeordnete ProteineDieser Ansatz wäre, nicht gültig sein.

Eine Variante der stufenweisen Gradienten IEC-SAXS hier vorgestellten Verfahren ist die Verwendung eines linearen Gradienten statt. Während es möglich ist, mit so vielen Schritten zu arbeiten, wie gewünscht Teilspitzen unter Verwendung eines stufenweisen Elution, in dem linearen Gradienten Ansatz zu isolieren, ist es erforderlich, die Steigung Bedingungen sorgfältig zu optimieren, um die Spitzen vollständig zu trennen, bevor die SAXS Start Experiment. Hintergrund Subtraktion in diesem Ansatz könnte rahmenweise getan werden, und konnte durch den Vergleich der einzelnen Frames überprüft werden, aber es erfordert erweiterte Datenverarbeitung und eine spezielle Software noch nicht existiert.

Die Wahl einer geeigneten Säule ist für beide Techniken kritisch, da sie die Trennung der makromolekularen Spezies bestimmt. Größenausschluss-Säulen unterscheiden sich in der Belastbarkeit, dem Größenbereich von trennbaren Makromoleküle und Auflösung, während Ionenaustauschsäulen in der Art variieren und die Dichteihrer immobilisiert Ladungen.

Während die hier vorgestellten Protokoll zur ESRF beamline BM29, Anpassung an andere SAXS-Strahllinie spezifisch ist im Prinzip einfach. Die wichtigsten Anforderungen sind eine ausreichend hohe Röntgenfluss und einem geeigneten Detektor (idealerweise Einzelphotonenzählung), vernünftigen Signal-zu-Rausch-Daten im Bereich von Sekunden zu erwerben oder weniger und eine Online-Flüssigkeits-Chromatographie System in der Lage zu schaffen Steigungen. Die genaue Umsetzung wäre natürlich, abhängig von der lokalen Umgebung-Strahlrohr.

Die erhaltenen Ergebnisse auf D5 323-785 die beiden Methoden unterscheiden sich geringfügig. Der Gyrationsradius ist etwas kleiner für die IEC-Daten als für die SEC-Daten und der lokalen Minima der Streukurve sind etwas größere Streuvektoren verschoben. Das bedeutet , dass die D5 323-785 gemessen mit IEC-SAXS ist etwas kompakter als die D5 323-785 gemessen mit SEC-SAXS. Dies könnte be aufgrund der Unterschiede in der Probenvorbereitung, in der Zeit zwischen Reinigung und Messung (IEC ist schneller) oder, weniger wahrscheinlich auf eine Verunreinigung in dem SEC-gereinigte Probe. Die Perle Modelle völlig unabhängig mit beiden Verfahren erhalten werden , sind vergleichbar (Abbildung 1H). D5 323-785 zeigt die erwartete hohle, hexameren Struktur 18.

Abschließend sind online Ionenaustausch- und Online – Grßenausschlußchromatographie wichtige biochemische Reinigungsverfahren , die direkt mit SAXS 6,7,9-12,25,26 koppelbar ist. Der Hintergrund Subtraktion von IEC-SAXS-Daten ist etwas schwieriger und zweideutig als für SEC-SAXS, aber es ist trotzdem möglich. In Abhängigkeit von den biophysikalischen Eigenschaften des Proteins von Interesse, sowohl SEC und IEC-SAXS ermöglichen die Optimierung der Spezies Trennung mit inhärenten Vorteile. Vorausgesetzt, dass die Validierungsschritte (wie beschrieben) sind wit korrekt beobachtet, können die resultierenden Daten analysiert werden,h Vertrauen und Modelle können mit den Standard-Tools zur Verfügung innerhalb der Gemeinschaft festgelegt werden. Zusammen ermöglichen die beiden Techniken Online-Trennung für eine breite Palette von biologischen Makromolekülen, wodurch man die Daten nicht zugänglich über Standard-statische Messungen.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Santé des Armées and the Délégation Générale pour l’Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.

Materials

1,4 dithiothreitol [DTT] Euromedex EU0006-B
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel Biorad 4561033
2x Phusion Flash PCR Master Mix ThermoFisher scientific F 548
acetic acid glacial VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20104.298
Agarose D-5 Euromedex LF45130653
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K Millipore Ltd UFC903024
Ampicillin sodium salt Euromedex EU0400-D
Benzonase Novagene 70750-3
bromophenol blue  MERCK 8122
Complete protease inhibitor cocktail  Roche 11231400
Econo-Pac 10 DG Desalting column Bio-rad 732-2010
EDTA Sigma E-5134
Glycerol VWR Chemicals (BDH Prolabo) 24388.295
Glycine Euromedex 26-128-6405-C
HindIII Roche 656313
HisSelect HF Nickel Affinity Gel Sigma H0537
Hydrochloric acid (HCl) VWR Chemicals (BDH Prolabo) 20252.295
Imidazole AppliChem Panreac A1073,0500
InstantBlue Expedeon ISB1L
LB broth Miller Fluka Analytical L3152
MgCl2 ICN Biomedicals Inc. 191421
NaCl VWR Chemicals (BDH Prolabo) 27808.297
NcoI Fermentas ER0571
One Shot BL21 Star (DE3)  ThermoFisher scientific C6010-03
pProEx HTb vector  Addgene 10711018
Primer  Eurofins mwg operon
QIAprep Spin Miniprep kit QIAGEN 27106
QIAquick Gel extraction kit QIAGEN 28706
QIAquick PCR purification kid QIAGEN 28106
SDS  Sigma 75746
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17-5172-01
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen life technology S33102
T4 ligase ThermoFisher scientific EL0011
TEV home made
TOP 10 Invitrogen life technology C404003 
Tris base Euromedex 26-128-3094-B
Uno Q 1R column  Bio-rad 720 0011
β-mercaptoethanol MPBiomedicals, LLC 194834
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Beamline control software BsXCuBE ESRF Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 local development
Camserver software Dectris n.a. detector control software
DAMAVER ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to align ab initio models 
DAMMIF ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html ab initio  model reconstruction programm
HPLC program Biologic Duo Flow Bio-rad
HPLC program LabSolutions Shimadzu n.a.
ISPyB ESRF De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. local development
PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program, which performs the manipulation with experimental SAXS
PyMOL DeLano Scientific LLC https://www.pymol.org/ software for visualization.
SUPCOMB ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html program to superimpose 3D structures
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioLogic Duo Flow Biorad
BioLogic Biofrac Fraction collector Biorad
HPLC system Shimadzu
Labsonic P Sartorius Stedim biotech BBI8535108
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References

  1. Graewert, M. A., Svergun, D. I. Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS). Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).
  2. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Sci. 19, 642-657 (2010).
  3. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).
  4. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  5. Vestergaard, B. Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions – Small-angle X-ray scattering to the rescue. Arch. Biochem. Biophys. , (2016).
  6. David, G., Pérez, J. Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline. J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).
  7. Graewert, M. A., et al. Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions. Sci. Rep. 5, (2015).
  8. Lambright, D., et al. Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS. ACA Trans. , 1-12 (2013).
  9. Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins. J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).
  10. Round, A., et al. Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).
  11. Watanabe, Y., Inoko, Y. Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics. J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).
  12. Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering. Acta Cryst. , (2016).
  13. Selkirk, C. Ion-exchange chromatography. Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).
  14. Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates. Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).
  15. Pernot, P., et al. Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution. J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).
  16. Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).
  17. Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases. Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).
  18. Hutin, S., et al. Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5. J. Virol. , 4604-4613 (2016).
  19. Round, A., et al. BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments. Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).
  20. De Maria Antolinos, A., et al. ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments. Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).
  21. Brennich, M. E., et al. Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29. J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).
  22. Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis. J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).
  23. Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra. Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).
  24. Schrodinger, LLC. . The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8. , (2015).
  25. Jensen, M. H., et al. Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange. J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).
  26. Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes. J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).

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Citer Cet Article
Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline. J. Vis. Exp. (119), e54861, doi:10.3791/54861 (2017).
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