챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
바이오 필름은 자체 분비 매트릭스으로 쌌다 박테리아의 그룹으로 구성되어 있습니다. 이들은 산업 오염뿐만 아니라 많은 건강 관련 감염 현상 및 지속성에 중요한 역할을한다. 인간의 질병에서 가장 잘 설명하고 연구 바이오 필름 중 하나는 낭포 성 섬유증 환자의 만성 폐 감염으로 발생합니다. 호스트의 컨텍스트에서 생물막을 연구 할 때, 여러 가지 요인이 바이오 필름 형성 및 발달에 영향을 미칠 수있다. 호스트 요인 생물막 형성 및 발달에 영향을 미칠 수있는 방법을 확인하기 위해, 우리는 객담 상청액의 형태로 숙주 – 유도 인자의 존재 생물막의 성장에 고정 커브 글라스 챔버 법을 이용했다. 박테리아는 챔버에 접종 및 객담 여과 액에 노출되어있다. 성장의 48 시간 이후, 생물막 전에 공 초점 현미경 및 분석에 상업 생물막 생존 키트로 염색된다. 이미지 획득 후, 바이오 필름 특성은 다른 소프트웨어 플랫폼을 사용하여 평가 될 수있다.이 방법은 우리가 항생제를 포함한 다양한 물질의 존재 생물막 성장의 주요 특성을 시각화 할 수 있습니다.
Introduction
세균 생물막은 서로에 부착되어 자기 분비 매트릭스 이탈되는 미생물의 기이다. 1,2- 고전, 그들은 물리적 흐름 조건 하에서 형성된 비 생물 적 또는 생물학적 표면에 부착 된 세균을 나타낸다. 바이오 필름은 또한 테스트 튜브에 형성된 열 풀 또는 펠리클의 공기 – 액체 계면의 표면과 같은 정적 상태 (흐름의 유무) 및 말단부에서 증가하는 것으로 나타났다. 그들은의 생물 연료, 부식 및 막힘의 결과, 저수지 또는 파이프에 형성 할 수있는 이러한 바이오 필름은 오래, 산업 공정에 큰 손해를 환경으로 인식하고 있습니다되었습니다. 3,4
그들은 카테터 관련된 감염, 낭포 성 섬유증 환자에서 폐 감염뿐만 아니라 수많은 다른 감염에 관여 된 바와 같이 바이오 필름은 또한 건강 관리 세팅에서 중요하다. 생물막 감염의 특징 중 5,6 하나는 드입니다항생제로 세균의 감수성을 주름과 선천성 면역 시스템에 의해 허가를 손상. 생물막 계 감염을 포함하는 7-9 가장 잘 연구, 임상 적 시나리오는 만성적 녹농균 생물막 감염된 낭포 성 섬유증 (CF), 환자에서 발생한다. 녹농균은 매우 어려운 치료를 할 수 있도록 만성 감염의 설립 동안 많은 변화를 겪을 수 있습니다. 10, 11 바이오 필름은 차등 선천성 면역을 활성화하고 염증을 구동 할 수있다. 이러한 감염은 CF 환자에서 증가 된 이환율 및 사망률을 초래할 12-14으로,이 컨텍스트에서 생물막 발달에 영향을 미칠 수있는 요인을 이해하는 것이 중요하다.
최근의 연구는 호스트 요인 녹농균 생물막 집계의 형성에 중요 제안합니다. 15이 바이오 필름은 항생제와 숙주 방어 메커니즘 감소 감수성에 기여한다. prese이러한 호중구 엘라 스타 제,뿐만 아니라, CF 폐에 존재하는 미생물로부터 분비 제품과 같은 숙주 유래 요인 NCE가 크게 생물막 형성 및 발달을 조절하는 잠재력을 가지고있다. (16) 또한, 바이오 필름은 다양한 경로의 발현을 조절하고 염증을 시작하는 호스트와 상호 작용합니다. 이러한 표준 크리스탈 바이올렛 분석 높은 처리량 방법, 생물막 공정에 관해서 몇 가지 정보를 제공 할 수 있지만, 이러한 요소에 대한 응답으로 바이오 필름의 시각화는보다 심층적 인 정보를 제공합니다.
이 논문에서는 체외 생물막의 개발 연구를 CF 환자의 객담에서 요소를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 상용 생물막 생존 키트를 사용 객담 함유 숙주 요인에 노출 생물막의 신속한 시각화 가능하다. 이 방법은 시각적 exogeno의 존재 생물막의 성장 중에 발생하는 변화를 식별하기 위해 사용될 수있다우리 제품 등 다양한 조건 하에서 생물막 개발의 변화를 분석하기위한 개선 된 방법을 나타낸다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본원에 기재된 방법은 외인성 제품의 존재 하에서 성장 세균 생물막의 시각화를 허용. 이러한 유형의 시스템을 사용하지 않을 때는 놀랍게도, exoproducts의 생산은 중요하다. 예를 들어, 디티 오 트레이 톨 (DTT)는 종종 샘플을 액화하기 위해 인간의 객담 샘플에 사용됩니다. 그러나, 단독 DTT의 효과 생물막 개발 가능성을 감소시킬 수있다 (데이터는 보이지 않음). 따라서, 모든 조건에 대한 적절한 통?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TB는 낭포 성 섬유증 캐나다에서 연구 교제를 인정합니다.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
