Визуализация Эффекты мокроте на биопленки развития с использованием модели Chambered покровного стекла
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
Биопленки состоят из групп бактерий, заключенная в самостоятельной секретируется матрице. Они играют важную роль в промышленном загрязнении, а также в развитии и настойчивости многих инфекций, связанных со здоровьем. Одним из наиболее хорошо изученных и описанных биопленок болезни человека происходит при хронической легочной инфекции у больных муковисцидозом. При изучении биопленки в контексте хозяина, многие факторы могут воздействовать на образование биопленки и развитие. Для того, чтобы определить, как факторы хозяина могут влиять на формирование и развитие биологической пленки, мы использовали статический метод камерные покровного стекла расти биопленки в присутствии факторов хозяина, полученных в виде мокроте супернатантов. Бактерии высевали в камеры и подвергаются мокроте фильтратов. После 48 ч роста, биопленки окрашивали коммерческой жизнеспособности биопленки комплекта до конфокальной микроскопии и анализа. После получения изображения, биопленки свойства могут быть оценены с использованием различных программных платформ.Этот метод позволяет визуализировать ключевые свойства роста биопленки в присутствии различных веществ, в том числе антибиотиков.
Introduction
Бактериальные биопленки группы микроорганизмов, которые прикреплены друг к другу и вписанные в себя секретируемый матрице. 1,2 Классически, они представляют собой бактерии , физически прикрепленные к абиотической или биотической поверхности , образованной в условиях потока. Биопленки, также было показано, чтобы расти в статических условиях (отсутствие потока) и дистально от поверхности, например, на границе раздела воздух-жидкость из термальных бассейнов или Плёночные образующихся в пробирках. Эти биопленки уже давно признаны в окружающей среде и являются одним из основных ущерба для промышленных процессов, так как они могут образовывать в водоемах или в трубах, в результате обрастания, коррозии и засорений. 3,4
Биоплёнки также имеют важное значение в медицинских учреждениях, так как они были показаны быть вовлечены в связанных с катетером инфекций, легочных инфекций у больных муковисцидозом, а также во многих других инфекций. 5,6 Один из признаков биопленки инфекции является деувеличилась восприимчивость бактерий к антибиотикам и нарушение клиренс врожденной иммунной системы. 7-9 Наиболее хорошо изучены, клинически значимых сценариев с участием биопленки на основе инфекции происходит у пациентов с кистозным фиброзом (CF), которые хронически инфицированы синегнойной биопленок. П. палочки может пройти ряд изменений во время установления хронической инфекции , которые делают его очень трудно поддается лечению. 10,11 биопленки может дифференцированно активировать врожденный иммунитет и привод воспаление. 12-14 Поскольку эти инфекции приводят к повышению заболеваемости и смертности у пациентов с МВ, крайне важно , чтобы понять факторы , которые могут повлиять на развитие биопленки в этом контексте.
Недавнее исследование предполагает , что хозяин-факторы имеют решающее значение в формировании агрегатов биопленки синегнойной. 15 Эти биопленки способствуют снижению восприимчивости к антибиотикам и механизмов защиты хозяина. Preseсть вмещающих полученных факторов, таких как эластазы нейтрофилов, а также секретируемых продуктов из микроорганизмов, присутствующих в легких при МВ, имеют потенциал, чтобы в значительной степени модулировать образование и развитие биопленки. 16 Кроме того, биопленки взаимодействовать с хозяином , чтобы модулировать экспрессию многочисленных путей и инициировать воспаление. В то время как высокие методы пропускной способности, такие как стандартного анализа кристаллического фиолетового, может предоставить некоторую информацию в отношении процесса биопленки, визуализация биопленки в ответ на эти факторы предоставляют больше информации в глубину.
В этой рукописи мы опишем метод с использованием коэффициентов из мокроты больных с МВ для изучения развития биопленок в пробирке. Этот метод позволяет быстро визуализации биопленки, подверженных мокроте, содержащей факторов хозяина с использованием коммерческого набора жизнеспособности биопленки. Этот метод может быть использован для визуального определения изменений, которые происходят во время роста биопленки в присутствии exogenoнам продукты, и представляет собой усовершенствованный метод для анализа изменений в развитии биопленки в различных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, описанные здесь, позволяют для визуализации бактериальных биопленок, выращенных в присутствии экзогенных продуктов. Не удивительно, что производство exoproducts имеет важное значение при использовании этого типа системы. Например, дитиотреитола (ДТТ), часто используется на образца…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ТБ признает исследовательскую стипендию от муковисцидоза Канады.
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
