Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
Identifikationen af funktionelle driver begivenheder i kræft er centralt for at fremme vores forståelse af kræft biologi og uundværlig for opdagelsen af den næste generation af nye lægemiddelkandidater. Det bliver tydeligt, at mere komplekse modeller for kræft er forpligtet til fuldt ud at værdsætte de medvirkende faktorer, som driver tumorigenese in vivo og øge effekten af nye behandlingsformer, der gør overgangen fra prækliniske modeller til kliniske forsøg.
Her præsenterer vi en metode til frembringelse af ensartede og reproducerbare tumor sfæroider, der kan underkastes siRNA funktionel screening. Disse sfæroider vise mange karakteristika, der findes i solide tumorer, der ikke er til stede i traditionel to-dimension kultur. Vi viser, at flere almindeligt anvendte brystkræft cellelinier er modtagelige for denne protokol. Desuden giver vi proof-of-principle data udnytter brystkræft cellelinje BT474, bekræfter deresafhængighed af amplifikation af den epidermale vækstfaktor receptor HER2 og mutation af phosphatidylinositol-4,5-biphosphat 3-kinase (PIK3CA), når de dyrkes som tumor sfæroider. Endelig er vi i stand til at undersøge og bekræfte den rumlige virkning af disse afhængigheder hjælp immunhistokemi.
Solide tumorer vise betydelig histologiske, genetiske og mikro-miljø intra-tumor heterogenitet, som præsenterer klinikere med en betydelig udfordring i at kunne behandle patienter med succes. De fleste modeller, der anvendes til at identificere nye målrettede behandlinger ikke indregnet mange af disse funktioner. Faktisk har de nuværende målrettede behandlinger anvendes i klinikken er udviklet i de sidste ti år beskæftiger screening tilgange, der er afhængige af kræft cellelinjer dyrket under todimensionale (2D) dyrkningsbetingelser. Selv om dette har medført forskellige succeser, såsom receptor tyrosinkinaseinhibitorer, bliver det klart, at mere komplekse modeller for kræft er forpligtet til fuldt ud at værdsætte de medvirkende faktorer, som driver tumorigenese in vivo og øge antallet af nye behandlingsformer, der gør overgangen fra prækliniske modeller til kliniske forsøg. Desuden er det nu godt forstås, at 2D kultursystemer ikke afspejler ivivo adfærd 1,2. For eksempel i dårligt vaskulariserede tumorer, da efterspørgslen efter ilt og næringsstoffer i mikromiljø overstige udbuddet, regioner høje og lave leverancer udvikler. Tilstedeværelsen af lave oxygen (hypoxia) i tumorer, som påvist ved den immunhistokemiske farvning af tumorsektioner for etablerede hypoxiske markører, såsom carbonanhydrase IX (Caïx), korrelerer med en dårligere klinisk resultat ved brystcancer 3,4 Således inkorporerer funktioner såsom hypoxi i screening-modeller kan forbedre vores evne til at opdage nye lægemiddelkandidater, der vil være mere effektive in vivo. Faktisk lykkedes rettet mod aggressive tumorer, der indeholder hypoxi er en klinisk prioritet 5.
Den forandring af traditionelle 2D siRNA screening, i et forsøg på at mere nøjagtigt rekapitulere elementer af de betingelser, der forekommer ved cancerceller i tumormikromiljøet, har ført til identificeringen af adskillige gener thpå har vist sig at være vigtigt for tumorvækst in vivo. Disse omfatter funktionelle genomiske skærme udført under lav serum forhold 6, hypoxiske forhold 7 og i kombination 8. For eksempel inaktivering af 6-Phosphofructo-2-kinase / fructose-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), et protein, der er ansvarlig for regulering af kulstof, der tilføres glycolyse, kun induceret apoptose i prostatakræft linjer afledt metastase ved dyrkning i lavt serum. Silencing af PFKFB4 i normale prostata-cellelinjer under de samme betingelser ikke havde nogen effekt, hvorimod, udtømning af PFKFB4 helt ablaterede væksten af prostatakræft cellelinje xenografter 6.
I en udstrakt panel af brystcancer cellelinjer, fortrinsvis undertrykkelse af mono-carboxylase transportør 4 (MCT4) førte til en reduktion af cellelinjen vækst under betingelser med lavt oxygenindhold. Denne sårbarhed blev valideret in vivo i brystcancercellelinie orthotrop xenograFTS. Måske mest slående, silencing af acetyl-CoA syntetase 2 (ACSS2), et enzym der er ansvarlig for omdannelse af acetat til acetyl-CoA, reduceret cancer celleantal under næringsstoffer stressbetingelser (lav oxygen og serum), men havde ringe eller ingen virkning på normale dyrkningsbetingelser 8. Ablation af ACSS2 påvirket væksten af brystkræft og prostatakræft implanteret tyder på, at næringsstoffer gradienter ikke eksisterer i isolation i tumor mikromiljø, og at celler, der bor i disse områder er afgørende for tumor progression 8. Endvidere ACSS2 viste sig også at være vigtige i glioblastom og hepatocellulære carcinomer 9,10, hvilket tyder på, at øget ACSS2 aktivitet i tumorer kan være en fundamental mekanisme, som understøtter vækst under ugunstige forhold.
Kollektivt, disse undersøgelser viser, at den gentog de betingelser, der forekommer in vivo og udførelse siRNA skærme giver mulighed for identifikation af genes essentielle for kræft overlevelse. Såvel som påvirker 2D cancervækst celle under næringsstoffer stressbetingelser, udtømning af målgener i disse undersøgelser inhiberede cancercellelinie kugleformet vækst, spejling, hvad der blev observeret i tumorxenotransplantater 6,8. Således cancercellelinie sfæroider indeholder flere af de forhold, hvorunder der tumormikromiljøet der forlener følsomhed over for ACSS2 silencing. Faktisk sfæroider vise farveforløb næringsstoffer (Serum og ilt), ændringer i pH, tre-dimensionelle (3D) celle-celle kontakt, men også, ændringer i proliferativ hurtighed med celler undergår cellecyklusstop og apoptose. Dette er eksemplificeret ved tilstedeværelsen i kræft sfæroider af nekrotiske områder, en funktion ikke findes i traditionelle 2D kultur.
Kræft celle sfæroider er allerede blevet anvendt som mere biologisk relevante modeller til at screene småmolekyleinhibitorer men dette kun giver mulighed for validering af forbindelsen effekt eller nyorientering af kompounds oprindeligt design for andre sygdomme 11. Aktuelle sfæroid screeningsmetoder ikke mulighed for analysen af specifikt gen udtømning i en high-throughput af højinformativ måde. Her beskriver vi for første gang, en funktionel genomforskning rørledning til at afdække specifikke gen afhængigheder anvender lille interfererende RNA (siRNA) teknologi i cancercellelinie sfæroider. Vi har designet en skræddersyet bibliotek med siRNA'er rettet mod de 200 hyppigst muterede gener i humane brystcancer og vurderet konsekvenserne af gen udtømning på klumpformet størrelse og metabolisk aktivitet i BT474 brystkræft sfæroider. Vi var i stand til robust og reproducerbart afsløre virkningen af ERBB2 og PIK3CA tavshed i 3D kulturer. Desuden kunne vi vurdere virkningen af gen udtynding på den rumlige arkitektur BT474 sfæroider hjælp immunhistokemi.
Tredimensionelle modeller af kræft i stigende grad anvendes til at evaluere effekten af kendte og hidtil ukendte forbindelser, der er designet til selektivt at dræbe cancerceller. Kræft celle sfæroider er strukturer, der viser forhold mere ligner dem, der findes i tumorer in vivo, således forbindelser, der har øget effektivitet i 3D er mere tilbøjelige til at have en effekt in vivo. Men disse modaliteter ikke mulighed for at identificere potentielt nye mål, som ikke har været genstand for narkotika design, der kunne have en betydelig effekt i behandling af kræft.
Vi udviklede et siRNA funktionel genomforskning tilgang, der er tilladt for varig gendæmpning i op til syv dage i kræft celle linje sfæroider. Der er flere kritiske trin til den protokol, der kræver optimering, før en siRNA skærm kan udføres. Evnen til at danne reproducerbare levedygtige sfæroider i stor skala er afgørende. Endvidere er enppropriate transfektionsbetingelser skal nøje optimeres. Vi foreslår trialing flere forskellige transfektionsreagenser med relevante ikke-målretning og drab kontroller inden du forsøger skærmen. Vi var i stand til at vise, at flere almindeligt anvendte brystkræft cellelinier, nemlig BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 og JIMT1 var modtagelig for siRNA transfektion. Desuden tilbyder vi proof-of-principle data screening de 200 hyppigst muterede gener i brystkræft i BT474 sfæroider, bekræftede deres afhængighed af opformering af HER2 og onkogen mutation af PIK3CA. Interessant silencing af transkriptionsfaktoren FOXO3 resulterede i en reduktion i sfæroid størrelse, men ingen signifikant virkning på levedygtighed. FOXO3 er kendt for at regulere respons på hypoxi, ændre den metaboliske kapacitet af kræftceller giver dem mulighed for at tilpasse sig lettere til deres omgivelser 16. Denne rolle kan potentielt forstyrre cellelevedygtigheden læsning som den opdager ATP overflod, En af de vigtigste produkter i cellens stofskifte.
Til støtte for observation af en reduktion i klumpformet størrelse, har det vist sig, at lyddæmpning af FOXO3 i HeLa-xenotransplantater forringet tumorvækst og induceret apoptose 17. Det er vigtigt at bemærke, at nogle gener kan påvirke kapaciteten af cancerceller for at bevare deres 3D arkitektur, hvilket kan resultere i falske positive. F.eks knockdown af E-cadherin resulterede i opløsning af BT474 klumpformet struktur. Dette var tidligere blevet rapporteret ved brug E-Cadherin målrettede antistoffer 18. Som med enhver screening platform, bør potentielle mål blive screenet igen for at vurdere reproducerbarheden af observerede virkning. Der er begrænsninger for den teknik, nemlig forbigående karakter af siRNA-medieret gen knockdown. Vedvarende tavshed længere end syv dage var ikke opnås med siRNA.
Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at den kan kobles med forskellige andre biometriske farvestoffer ikke kun dem, der vurderer klumpformet levedygtighed, for eksempel, giver geografisk information af klumpformet hypoxi eller overvågning celler undergår apoptose. Desuden fordi plade læseren scanninger er relativt hurtig og ikke-invasiv, virkningen af siRNA'er på klumpformet størrelse kan vurderes over tid i stedet for blot på forsøgsstadiet slutpunktet. Faktisk er vi undersøger i øjeblikket flere af disse muligheder inden for vores screening pipeline. En alternativ fremgangsmåde, der udnytter 3D-kulturer til at identificere hidtil ukendte afhængigheder er anvendelsen af kemiske biblioteker, som inhiberer enten en bred vifte af mål eller bestemte familier af proteiner. Faktisk Bitler et al. udnyttet denne målrettede tilgang til at identificere den syntetiske dødelighed samspillet mellem ARID1A status og EZH2 inhibitorer i æggestokkene klare celle carcinomer 19. Opdagelsen af CRISPR-Cas9 gen redigering teknologi har også tilladt for udviklingen af genetiske skærme i organoide kulturer og in vivo. Men thans tilgang er afhængig af at have passende dyrefaciliteter og kan koste uoverkommelige 20.
Afslutningsvis mener vi, at vi har skitseret en protokol, som mere præcist modeller ilt- og næringsstoffer forløb, som er funktioner i tumor mikromiljø in vivo, der giver mulighed for identifikation af nye cancer mål eller robust validering af de fastsatte mål. Endvidere kan vores protokol anvendes på enhver type cellelinie, som danner sfæroider og dermed kan rutinemæssigt anvendes i kræftforskning community for high-throughput siRNA skærme.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |