Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer
Summary
Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
Abstract
De identificatie van functionele gebeurtenissen bestuurder bij kanker staat centraal in een beter inzicht in de biologie van kanker en onmisbaar voor de ontdekking van de volgende generatie van nieuwe drug targets. Wordt duidelijk dat meer complexe modellen van kanker moeten de factoren die in vivo tumorigenese rijden en verhoging van de effectiviteit van nieuwe therapieën dat de overgang van pre-klinische modellen klinische proeven te waarderen.
Hier presenteren we een methode voor het genereren van uniforme en reproduceerbare bolvormige tumoren die kunnen worden onderworpen aan functionele siRNA screening. Deze sferoïden vertonen veel kenmerken die worden gevonden in vaste tumoren die niet in traditionele tweedimensionale cultuur. We laten zien dat diverse veelgebruikte borstkankercellijnen vatbaar zijn voor dit protocol. Verder bieden we proof-of-principle data met behulp van de borstkanker cellijn BT474 bevestigt hunafhankelijkheid amplificatie van de epidermale groeifactor receptor HER2 en mutatie van fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat 3-kinase (PIK3CA) wanneer gekweekt als bolvormige tumoren. Tot slot, we zijn in staat om verder te onderzoeken en te bevestigen de ruimtelijke impact van deze afhankelijkheden met behulp van immunohistochemie.
Introduction
Vaste tumoren tonen significante histologische, genetische en micro-milieu intra-tumor heterogeniteit, die clinici presenteert een aanzienlijke uitdaging voor het succesvol kunnen behandelen patiënten. De meerderheid van de modellen die worden gebruikt om nieuwe te identificeren gerichte therapieën niet veel van deze functies op te nemen. Inderdaad hebben de huidige gerichte therapieën gebruikt in de kliniek ontwikkeld in de afgelopen tien jaar dienst screeningsmethoden die afhankelijk kankercellijnen gekweekt onder tweedimensionale (2D) kweekomstandigheden. Hoewel dit over verschillende successen, zoals receptor tyrosinekinaseremmers is gebracht, wordt steeds duidelijker dat complexere modellen van kanker moeten de factoren die tumorigenese rijden in vivo en het aantal van nieuwe therapieën die de overgang van maken volle waarderen preklinische modellen klinische proeven. Bovendien is het nu goed begrepen dat 2D kweeksystemen niet om na te denken devivo gedrag 1,2. Bijvoorbeeld in slecht gevasculariseerde tumoren, omdat de vraag naar zuurstof en voedingsstoffen in de micro overtreffen levering, gebieden van hoge en lage leveringen ontwikkelen. De aanwezigheid van weinig zuurstof (hypoxie) in tumoren, zoals gedetecteerd door de immunohistochemische kleuring van tumorsecties voor gevestigde hypoxische merkers zoals koolzuur anhydrase IX (CAIX), correleert met een slechtere klinische uitkomst bij borstkanker 3,4 Aldus kenmerkende eigenschappen zoals hypoxie in screening modellen kunnen onze capaciteit te vergroten om nieuwe drug targets die meer werkzaam in vivo zal ontdekken. Inderdaad, met succes op agressieve tumoren die hypoxie bevatten een klinische prioriteit 5.
Het veranderen van traditionele 2D siRNA screening, in een poging om nauwkeuriger recapituleren elementen van het waarmee kankercellen in de tumor micro omstandigheden, heeft geleid tot de identificatie van verschillende genen thbij gevonden belangrijk tumorgroei in vivo. Deze omvatten functionele genomische screens uitgevoerd onder lage serum condities 6, hypoxische omstandigheden 7 en in combinatie 8. Bijvoorbeeld, onderdrukking van 6-Phosphofructo-2-kinase / fructose-2,6-bisfosfatase 4 (PFKFB4), een eiwit dat verantwoordelijk is voor het reguleren van koolstof die glycolyse, alleen geïnduceerde apoptose in prostaatkankerlijnen afgeleid van metastase wanneer gekweekt in laag serum. Silencing van PFKFB4 in normale prostaat cellijnen die onder dezelfde omstandigheden had geen effect, terwijl, uitputting van PFKFB4 volledig weggenomen de groei van prostaatkanker cellijn xenotransplantaten 6.
In een uitgebreid panel van borstkankercellijnen, de onderdrukking van mono-carboxylase transporter 4 (MCT4) bij voorkeur geleid tot een vermindering van de cellijn groei onder omstandigheden van lage zuurstof. Dit beveiligingslek is gevalideerd in vivo bij borstkanker cellijn orthotroop xenografts. Misschien het meest opvallend, zwijgen Acetyl-CoA synthetase 2 (ACSS2), een enzym dat verantwoordelijk is voor het omzetten acetaat in acetyl-CoA, verminderde kankercel toegekend nutriënten stresscondities (laag zuurstof en serum), maar had weinig of geen effect bij normale kweekomstandigheden 8. Ablatie van ACSS2 invloed op de groei van borst- en prostaatkanker xenotransplantaten suggereren dat voedingsstoffen hellingen bestaan niet afzonderlijk in de tumor micro-omgeving en die cellen die in deze gebieden bevinden essentieel zijn voor tumorprogressie 8. Verder werd ook gevonden ACSS2 belang glioblastoma en hepatocellulaire carcinomen 9,10 te zijn, wat suggereert dat verhoogde ACSS2 activiteit in tumoren een fundamenteel mechanisme dat de groei ondersteunt onder ongunstige omstandigheden zijn.
Tezamen zijn deze studies tonen aan dat de indient aangetroffen in vivo omstandigheden en het uitvoeren van siRNA schermen maakt de identificatie van genes van essentieel belang voor de overleving van kanker. Naast invloed 2D kankercelgroei onder stressomstandigheden voedingsstoffen, uitputting van doelwitgenen in deze studie remde kankercellijn sferoïde groei weerspiegelen wat werd waargenomen bij 6,8 tumorxenotransplantaten. Aldus kanker cellijn sferoïden bevatten verschillende van de aangetroffen in de tumor micro voorwaarden die gevoeligheid voor ACSS2 silencing geven. Inderdaad, sferoïden tonen voedingsstoffen gradiënten (Serum en zuurstof), veranderingen in pH, driedimensionale (3D) cel-cel contact, maar ook veranderingen in proliferatieve celerity met cellen ondergaan celcyclus en apoptose. Dit wordt geïllustreerd door de aanwezigheid van kanker sferoïden van necrotisch gebieden, een eigenschap die niet in traditionele 2D cultuur.
cel kanker sferoïden zijn al gebruikt als biologisch relevante modellen kleinmoleculige remmers te screenen maar staat alleen voor de validatie van verbinding werkzaamheid of herbestemming van compounds oorspronkelijk ontwerpen voor andere ziekten 11. Sferoïde huidige screeningsmethoden niet toelaten de analyse van specifieke genen depletie in een high-throughput of high content wijze. Hier beschrijven we voor de eerste keer, een functionele genomics pijpleiding voor het blootleggen specifiek gen afhankelijkheden gebruikmaking klein interfererend RNA (siRNA) techniek bij kanker cellijn sferoïden. We ontwierpen een op maat gemaakte bibliotheek met siRNA gericht op de 200 meest frequent gemuteerde genen in humane borstkanker en onderzocht de impact van gen uitputting op spheroïde grootte en de metabolische activiteit in BT474 borstkanker sferoïden. We waren in staat om de impact van ErbB2 en PIK3CA zwijgen in 3D culturen robuust en reproduceerbaar te sporen. Bovendien kunnen we de impact van gen uitputting op de ruimtelijke architectuur van BT474 bolletjes met behulp van immunohistochemie beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Driedimensionale modellen van kanker worden steeds meer gebruikt om de werkzaamheid van bekende en nieuwe verbindingen die zijn ontworpen om selectief kankercellen doden evalueren. Cel kanker sferoïden zijn structuren die voorwaarden meer op die aangetroffen in tumoren in vivo geven, dus verbindingen die in 3D toegenomen werkzaamheid eerder effect in vivo heeft. Echter, deze wijze niet kunnen vaststellen van potentieel nieuwe targets geen onderwerp van geneesmiddelontwerp die aanzienlijke werkzaamheid bij de behandeling van kanker zou geweest zijn.
We ontwikkelden een siRNA functionele genomica benadering die manier konden voor duurzame gene silencing voor maximaal zeven dagen bij kanker cellijn sferoïden. Er zijn een aantal kritische stappen om het protocol dat optimalisatie vereisen voordat een siRNA scherm kan worden uitgevoerd. De mogelijkheid om reproduceerbare levensvatbare sferoïden vormen op grote schaal is essentieel. Bovendien is eenppropriate transfectie voorwaarden moeten strikt worden geoptimaliseerd. We raden trialing verschillende transfectiereagentia met aangewezen niet-targeting en het doden van de controles voorafgaand aan het proberen het scherm. We konden aantonen dat verschillende veelgebruikte borstkankercellijnen, namelijk BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 en JIMT1 waren ontvankelijk voor siRNA transfectie. Verder bieden we proof-of-principle data screening van de 200 meest frequent gemuteerde genen bij borstkanker in BT474 sferoïden, bevestigden hun afhankelijkheid van de amplificatie van HER2 en oncogene mutatie van PIK3CA. Interessant is silencing van de transcriptiefactor FOXO3 resulteerde in een vermindering van bolvormige grootte, maar geen significant effect op de levensvatbaarheid. FOXO3 is bekend dat de reactie op hypoxie reguleren, veranderen de metabole capaciteit van kankercellen waardoor ze gemakkelijker aanpassen aan hun omgeving 16. Deze rol zou kunnen interfereren met de cellevensvatbaarheid lezen als het ATP overvloed detecteertEen van de belangrijkste producten van de celstofwisseling.
Ter ondersteuning van de waarneming van een vermindering in grootte bolvormige, werd aangetoond dat silencing van FOXO3 in HeLa xenotransplantaten verminderde tumorgroei en 17 geïnduceerde apoptose. Het is belangrijk op te merken dat sommige genen het vermogen van kankercellen om hun 3D architectuur, wat kan leiden tot vals positieven behouden kunnen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, knockdown van E-cadherine geleid oplossen van BT474-bolvormige structuur. Dit was eerder gerapporteerd met behulp van E-cadherine antilichamen gericht 18. Zoals bij elke screeningsplatform moeten potentiële doelwitten opnieuw worden gescreend om de reproduceerbaarheid van het effect waargenomen beoordelen. Er zijn beperkingen aan de techniek, te weten de voorbijgaande aard van de siRNA-gemedieerde gen knockdown. Aanhoudende zwijgen langer dan zeven dagen was niet haalbaar met siRNA.
Het voordeel van deze aanpak is dat het kan worden gecombineerd met verschillende andere biomesche kleurstoffen niet alleen die bolvormige levensvatbaar zal zijn, bijvoorbeeld, waardoor ruimtelijke informatie van sferoïde hypoxie of controle cellen apoptose ondergaan. Omdat bovendien de plaatlezer scans relatief snelle en niet-invasieve, het effect van siRNA's op sferoïde grootte kan worden beoordeeld in de tijd in plaats van alleen aan de experimentele eindpunt. Sterker nog, zijn we momenteel het verkennen van een aantal van deze mogelijkheden binnen onze screening pijplijn. Een alternatieve benadering die 3D culturen gebruikt om nieuwe afhankelijkheden identificeren is het gebruik van chemische bibliotheken die ofwel een groot aantal targets of bepaalde families van eiwitten remmen. Inderdaad, Bitler et al. gebruikt deze gerichte aanpak van de synthetische dodelijkheid interactie tussen de status ARID1A en EZH2 inhibitors te identificeren in de eierstokken clear cell carcinoma 19. De ontdekking van CRISPR-Cas9 gen-editing technologie heeft ook de ontwikkeling mogelijk van genetische screens in organoïde culturen en in vivo. Echter, tZijn aanpak is afhankelijk van het hebben van de juiste dier faciliteiten en kunnen worden onbetaalbaar 20.
Tot slot zijn wij van mening dat we een protocol hebben geschetst dat nauwkeuriger modellen van de zuurstof en voedingsstoffen gradiënten, welke kenmerken van de tumor micro-omgeving in vivo, waardoor de identificatie van nieuwe targets kanker of uitgebreide validatie van de vastgestelde doelen zijn. Bovendien kan ons protocol worden toegepast op elk type cellijn die sferoïden vormen en derhalve kan routinematig worden gebruikt in het kankeronderzoek gemeenschap high-throughput siRNA schermen.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Materials
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
References
- Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
- Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
- Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
- Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
- Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
- Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
- Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
- Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
- Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
- Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).
