Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and α/β C-termini, can be quantified.
Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (ΔS) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (α) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (β). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3‘s four spliced transcripts (Sα, Sβ, ΔSα and ΔSβ) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants’ levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.
शॉर्ट रेंज (मिलकर) वैकल्पिक splicing है, जहां वैकल्पिक स्वीकर्ता या दाता साइटों एक दूसरे के करीब निकटता में हैं, स्तनधारियों 1, 2 अकशेरुकी और पौधों 3 में आम है। यह अनुमान है कि स्तनधारी जीन के 20% वैकल्पिक ब्याह साइटों के अलावा 2-12 न्यूक्लियोटाइड 4 होते हैं। इन साइटों में से कई 3 न्यूक्लियोटाइड अलग कर रहे हैं और शामिल किए जाने या एक ही कोडोन के बहिष्कार में परिणाम। इन साइटों 5,6 कुछ बहस के साथ कम से splicing नियमन की प्रकृति के बारे में बहस है कि splicing मूल भाव मतभेद, इतना सूक्ष्म है कि चयन स्टोकेस्टिक 7 हैं, जबकि अन्य ऊतक विशिष्टता 8 के आधार पर नियमन अनुमान है।
मिलकर ब्याह साइट चयन विश्लेषण किया गया है अर्द्ध मात्रात्मक संशोधित केशिका वैद्युतकणसंचलन 7, और उच्च संकल्प जेल वैद्युतकणसंचलन 8 का उपयोग। शाही सेना Seq (आरएनए अनुक्रमण) पढ़ता प्रत्येक ब्याह में splicing के अनुपात में यों इस्तेमाल किया जा सकता हैसाइट। इस तरह, शाही सेना Seq डेटा मिलकर ब्याह साइटों 9 के नियमन के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान की गई है। यह भी उम्मीद ब्याह संस्करण न्यूक्लियोटाइड मूल भाव 10 अनुपात के आधार पर की भविष्यवाणी के लिए सक्षम है। भी शामिल है कि या शामिल नहीं है एक भी कोडोन और आमतौर पर होने वाली मिलकर स्वीकर्ता ब्याह साइटों, NAGNAGs (जहां एन किसी भी न्यूक्लियोटाइड =) के रूप में जाना जाता है पर किया गया है splicing पर जोर देने के अधिकांश।
मिलकर दाता वैकल्पिक ब्याह सहित या (GYNGYN मान्यता आकृति, जहां वाई = pyrimidine) एक एकल कोडोन छोड़कर साइटों मिलकर स्वीकारकर्ताओं से कम आम हैं। सिग्नल ट्रांसड्यूसर और प्रतिलेखन 3 (Stat3) का उत्प्रेरक मिलकर दाता वैकल्पिक splicing 1,11 दौर से गुजर रहा एक महत्वपूर्ण जीन है। मिलकर दाता ब्याह साइटों एक्सॉनों 21 और 22 में शामिल होने और सेरीन-701 (S या ΔS क्रमशः) 1,11 के लिए शामिल किए जाने या कोडोन के बहिष्कार में परिणाम। डाउनस्ट्रीम विकल्प स्वीकर्ता साइटों (एक दूसरे से 40 न्यूक्लियोटाइड के अलावा) में शामिल होने एक्सॉनों 22 औरTransactivation डोमेन (α) या 7 अनोखी सी टर्मिनल अवशेषों (β) 11 के साथ एक छोटा transactivation डोमेन के दोनों 55 टर्मिनल अवशेषों के शामिल किए जाने में 23A / बी नतीजा है। इसलिए, चार ब्याह वेरिएंट संभव हो रहे हैं।
Stat3 प्रोटीन एक प्रतिलेखन कारक है और कई प्रकार की कोशिकाओं के 12 में प्रमुख संकेत करनेवाला है और जब उत्परिवर्तित अपने विधान सक्रियण कई कैंसर phenotypes (संदर्भ 13 में समीक्षा) के लिए योगदान देता है। अय्यूब के सिंड्रोम, एक इम्यूनो विकार आईजीई का उच्च स्तर की विशेषता है, यह भी Stat3 में परिवर्तन के कारण होता है (संदर्भ 14 में समीक्षा)। Stat3 α और β ब्याह संस्करण प्रोटीन के लिए अलग भूमिकाओं के पहले किया गया है 15 में वर्णित है। प्रारंभ में, Stat3 β एक प्रमुख नकारात्मक ढंग से 16 में कार्य करने के लिए, Stat3 α के transcriptional गतिविधि को नाराज करने के बारे में सोचा था, लेकिन बाद में काम सुझाव यह स्वतंत्र लक्ष्य जीन 17 है </s> अप। मिलकर splicing की सूक्ष्मता के बावजूद, वहाँ अभाव या सेरीन-701 (Ser701) प्रभावों समारोह की उपस्थिति पर विश्वास करने का कारण है। इतना ही नहीं Ser701 tyrosine-705 (छाछ Stat3 सक्रियण 18 में phosphorylated) के करीब निकटता में है, लेकिन हाल ही में एक अध्ययन से पता चलता है कि Stat3 एस और ΔS ब्याह वेरिएंट दोनों आवश्यक Stat3 आदी फैलाना बड़े बी सेल लिंफोमा (DLBLCL) की व्यवहार्यता के लिए हैं 19 कोशिकाओं। जैविक प्रासंगिकता का पता लगाया जाना बाकी है। यह देखते हुए कि ब्याह संस्करण रचना समारोह को प्रभावित कर सकता है, हम है कि क्या अनुपात eosinophils में साइटोकाइन उत्तेजना से परेशान था की खोज करने का प्रयास किया।
हम शुरू में Stat3 α और β ब्याह वेरिएंट के लिए पीसीआर विशिष्ट, एक प्रतिबंध के साथ उत्पादों की दरार द्वारा बाद का उपयोग एस ब्याह वेरिएंट, AfeI के लिए विशेष एंजाइम द्वारा दो splicing घटनाओं के बीच संबंध का पता लगाने का प्रयास किया। उत्पादों की densitometry शामिल किए जाने के संकेत Ser701 r थाoughly दस गुना अधिक अपनी चूक (ΔS) दोनों Stat3 α और β की तुलना में आम (डेटा) नहीं दिखाया। हालांकि, इस अर्द्ध मात्रात्मक दृष्टिकोण पर्याप्त प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं था, और प्रभावी ढंग से इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है मापने के लिए सभी चार ब्याह एक साथ वेरिएंट। चार ब्याह वेरिएंट में से प्रत्येक के अनुपात का विश्लेषण करने के लिए, यह एक मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) प्रोटोकॉल है कि तंग तकनीकी (किसी नमूने के कई assays) झुकेंगे स्थापित करने के लिए जरूरी हो गया था दोहराता है।
सापेक्ष qPCR एक मानक या गृह व्यवस्था एक विशेष स्तर 20 में व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है जीन के लिए ब्याज की एक जीन की तुलना पर निर्भर करता है और उचित है जब ब्याज और गृह व्यवस्था जीन की जीन समान दक्षता के साथ परिलक्षित कर रहे हैं। एक डबल असहाय (डी एस) डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोसेंट (जाती) डाई पीसीआर amplicons 21 को बांधता है, और चक्र का एक निश्चित संख्या के बाद, पर्याप्त प्रवर्धन प्रतिदीप्ति के लिए हुआ है detectable होने के लिए। उच्च प्रारंभिक स्तरप्रतिलिपि के, कम सीमा चक्र (सीटी) मूल्य। चूंकि सीडीएनए तैयारियों की एकाग्रता अलग है, एक eosinophils 22 में एक प्रतिलिपि सभी नमूनों में लगातार स्तर पर व्यक्त किया जा करने के लिए जाना जाता है, glucuronidase-β (GUSB) की तरह की एकाग्रता के साथ प्रतिलेख की एकाग्रता की तुलना करने की जरूरत है।
सापेक्ष qPCR मिलकर splicing से उत्पन्न ब्याह वेरिएंट के रूप में देखा, अत्यधिक इसी तरह के दृश्यों के लिए संभव नहीं है। कड़े विशेष रूप से ब्याह वेरिएंट बढ़ाना आवश्यक शर्तों में कमी आई दक्षता में परिणाम। इसके बजाय, पूर्ण मात्रा का ठहराव 23 इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यह ब्याज की spliced प्रतिलेख के ज्ञात सांद्रता के साथ एक मानक वक्र तैयारी ठीक करता है, और यह सुनिश्चित करना पीसीआर की स्थिति विशिष्टता 24 अनुकूलन। के रूप में वर्णित है, एक विशेष जीन के लिए निरपेक्ष और सापेक्ष qPCR डेटा एक विशेष सेल प्रकार में जीन की अभिव्यक्ति की समझ को सूचित करने में विलय किया जा सकताविभिन्न प्रेरित eosinophils 25 में इस मामले Stat3।
इस के साथ साथ, Stat3 ब्याह संस्करण मात्रा का ठहराव उम्मीद है कि विधि अन्य संगठनों ने मिलकर splicing घटनाओं के लक्षित पढ़ाई के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के साथ वर्णन किया गया है। अनुकूलन एक लंबी प्रक्रिया है, जहां विभिन्न सांद्रता और साइकिल चालन के मापदंडों के कई पुनरावृत्तियों में कई प्राइमर जोड़े में कुछ महीने के कोर्स पर परीक्षण किया गया था। प्रोटोकॉल की प्रमुख विशेषताओं में प्राइमर विशिष्टता सत्यापन और मात्रा का ठहराव ब्याह वेरिएंट के ज्ञात सांद्रता के साथ मानक घटता के आधार पर कर रहे हैं। संयोजन के रूप में सापेक्ष qPCR हमारे आवेदन के लिए मददगार साबित हुआ है, लेकिन जरूरी नहीं है।
हम आदेश का स्तर और eosinophils और लिंफोमा कोशिकाओं में Stat3 ब्याह संस्करण टेप के अनुपात का आकलन और जानने के साइटोकाइन उत्तेजना का स्तर और अनुपात प्रभावित है कि क्या करने के लिए इस प्रोटोकॉल विकसित की है। (संदर्भ 33 में समीक्षा) Stat3, इसके pleiotropic और अनिश्चित कार्यक्षमता की वजह से विशेष रुचि का है कि क्या यह एक oncoprotein या कैंसर में ट्यूमर शमन के रूप में कार्य पर परस्पर विरोधी रिपोर्टों के साथ। Stat3 α और β ब्याह संस्करण समारोह में मतभेद पहले से 34,35 विशेषता किया गया था, और हमारे प्रोटोकॉल एक तोड़े नीचे / फिर से अभिव्यक्ति विश्लेषण है कि एस के एक इष्टतम अनुपात के लिए एक की जरूरत का सुझाव मदद की और ΔS टेप 19।
अलग ब्याह वेरिएंट की सही मात्रा का ठहराव विषम Stat3 समारोह से संबंधित संस्करण रचना ब्याह करने की आगे की जांच की सुविधा होगी। प्रोटोकॉल निरपेक्ष और सापेक्ष qPCR डेटा को एकीकृत, अटल बिहारी की क्षमता के संयोजनघुला हुआ पदार्थ qPCR ब्याह संस्करण अनुपात की गणना करने के लिए, और रिश्तेदार qPCR समग्र Stat3 अभिव्यक्ति में परिवर्तन को मापने के लिए। यह दृष्टिकोण एक दो वैकल्पिक ब्याह साइटों को और अधिक से अधिक 50 न्यूक्लियोटाइड अलावा में अनुक्रम में सूक्ष्म अंतर splicing अनुपात में भेद और एक साथ मापने के लिए अनुमति देता है। Splicing घटनाओं के अनुपात का निर्धारण व्यक्तिगत रूप से उल्लेखनीय लग रहा है कि एक सह splicing पूर्वाग्रह ऐसी ही अस्तित्व में ΔSβ स्तरों यदि दो साइटों का उपयोग करता है बेतरतीब ढंग से 25 spliced रहे हैं प्रत्याशित की तुलना में अधिक हैं कि झुकेंगे नहीं होता।
गंभीर, प्लाज्मिड अंशांकन घटता के उपयोग के साथ पूर्ण qPCR ब्याह बदलाव है कि अत्यधिक इसी तरह के दृश्यों में परिणाम की (उप इष्टतम क्षमता पर) मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। हम आशा करते एक उपन्यास सूक्ष्म splicing qPCR परख मोटे तौर पर दो महीने का समय लग अनुकूलन करने के लिए करना चाहिए। परख विकास में महत्वपूर्ण कदम निरपेक्ष qPCR के लिए मानक घटता पैदा करने में इस्तेमाल किया Stat3 plasmids की रचना कर रहे हैं; तजरबा सेइष्टतम प्राइमर दृश्यों और साइकिल चालन के मापदंडों का निर्धारण विशिष्टता और reproducibility सुनिश्चित करने के लिए; और रिश्तेदार qPCR डेटा के एकीकरण बढ़ाता GAPDH अभिव्यक्ति के लिए अखिल Stat3 अभिव्यक्ति रिश्तेदार से निकाली गई। नकल संख्या के संबंध संचयी मात्रा का ठहराव बनाम Stat3 पैन द्वारा मात्रा (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) से पता चलता है कि प्रोटोकॉल विश्वसनीय परिणाम पैदा करता है।
तकनीक का एक चेतावनी व्यापक मान्यता प्रक्रिया है। यह इंट्रा-परख परिवर्तनशीलता (repeatability), interassay परिवर्तनशीलता (reproducibility) और विशिष्टता का आकलन करने के लिए आवश्यक है। प्रोटोकॉल इन मापदंडों के लिए सांख्यिक outputs पाने के लिए तरीके की रूपरेखा। हम दक्षता समझा ≥75%, विशिष्टता कारक ≥4, भिन्नता (reproducibility) के गुणांक ≤10% और सीटी मानक विचलन (repeatability) ≤0.2 के रूप में उपयुक्त थ्रेसहोल्ड 30। म्यूटेशन या Stat3 अनुक्रम अमीनो एसिड 1-690 में विलोपन discove नहीं होगा, इस प्रोटोकॉल द्वारा लाल हालांकि वे splicing अनुपातों को प्रभावित कर सकता है। ट्रांसक्रिप्ट अनुपात अनुपात 36 proteoform के लिए आनुपातिक नहीं हो सकता है।
चूंकि नमूनों की कुल सीडीएनए की मात्रा शुरू भिन्न है, निरपेक्ष qPCR एक नमूना भीतर ब्याह वेरिएंट की प्रतिलिपि संख्या की तुलना लेकिन अंतर-नमूना तुलना के लिए नहीं है जब तक कि एक स्थापित गृह व्यवस्था जीन का उपयोग कर रिश्तेदार qPCR के साथ युग्मित के लिए उपयुक्त है। विधि reproducibility 30 के लिए MiQE qPCR दिशा निर्देशों के अनुरूप करार दिया। पीसीआर साइकिल चालन के मापदंडों और प्राइमर सांद्रता प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए अगर अन्य उपकरणों का इस्तेमाल किया जाता है संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है। बिल्कुल सही विशिष्टता काफी समझौता किए दक्षता के बिना संभव नहीं है, लेकिन लक्ष्य परिमाण के आदेश के एक से अधिक चार से अधिक कुशलता से परिलक्षित किया गया था।
रैखिक डीएनए परिपत्र की तुलना में अधिक आसानी से परिलक्षित होता है। एक वैकल्पिक प्लाज्मिड संतोषजनक मानक घटता प्रदान नहीं करता है (2 आर <; 0.95), मात्रा का ठहराव के लिए पहले ही साइट प्रतिबंध से प्लाज्मिड linearizing पर विचार करें। अनुकूलन qPCR अच्छी गुणवत्ता डेटा (चित्रा 1) प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। अधिकांश qPCR प्रोटोकॉल दो कदम साइकिल पर भरोसा करते हैं, और मशीनों के हिसाब से अनुकूलित कर रहे हैं। हीटिंग ब्लॉक की गैर वर्दी हीटिंग तीन कदम साइकिल चालन में exacerbated किया जा सकता है, गरीब repeatability में योगदान दे। Assays आदर्श एक समर्पित लामिना का प्रवाह हुड में, फिल्टर पिपेट सुझावों और ultrapure पानी के साथ बाँझ शर्तों के तहत स्थापित किया जाना चाहिए। क्योंकि दूषित पदार्थों को असंगत परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, assays अप फिल्टर पिपेट सुझावों और ultrapure पानी के साथ बाँझ शर्तों के तहत, आदर्श एक समर्पित लामिना का प्रवाह हुड में स्थापित किया जाना चाहिए। QPCR अनुकूलन के बारे में अधिक जानकारी के लिए Bustin एट अल को देखें। 32
बढ़ाता Stat3 संदर्भों की एक संख्या में अधिक से अधिक जानकारी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। अपने स्वयं के अभिव्यक्ति 37 Stat3 ऑटो को नियंत्रित करता है, और प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित मदद मिल सकती हैस्पष्ट करने के लिए है कि क्या Stat3 ब्याह वेरिएंट के अनुपात में इस सकारात्मक प्रतिक्रिया पाश को विनियमित करने के लिए योगदान करते हैं। प्रोटोकॉल के रूप में अलग-अलग घनत्व 38 पर या विकास के पाठ्यक्रम पर कोशिकाओं में मनाया ब्याह संस्करण अनुपातों में बदलाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: यह ज्ञात है कि hematopoiesis 16 के दौरान प्रोटीन के स्तर पर Stat3 α / β अनुपात बदल जाता है। Sundin एट अल। पाया गया कि एक intronic एकल nucleotide बहुरूपता पक्षपाती एक्सॉन 12 के Stat3 में नौकरी सिंड्रोम 39 के साथ एक रोगी के splicing। ऐसा नहीं है कि एक्सॉन 21 और 22, या एक्सॉन 22 और 23 के बीच इंट्रोन्स में मौजूद कई SNPs में से एक क्रमशः ΔS / एस के splicing अनुपात और α / β में योगदान कर सकते बोधगम्य है। परख कैंसर कोशिकाओं, जहां म्यूटेशन या splicing नियमन में परिवर्तन splicing प्रक्रिया से 40 पूर्वाग्रह पेश हो सकता है में Stat3 टेप यों इस्तेमाल किया जा सकता है। Splicing कारकों में म्यूटेशन (SF3B1 की तरह), observ के रूप मेंMyelodysplastic सिंड्रोम 41 में प्रवर्तन निदेशालय भी परिवर्तन है कि इस प्रोटोकॉल के द्वारा मापा जा सकता है हो सकता है।
अधिक मोटे तौर पर, इस दृष्टिकोण विशेष रूप से पता लगाता है splicing में सह एसोसिएशन, जो पारंपरिक शाही सेना Seq, और न ही मानक qPCR के साथ संभव नहीं है। परस्पर अनन्य एक्सॉन splicing की घटना splicing फैसले के समन्वय को दर्शाता है, वहीं अन्य splicing घटनाओं के सह एसोसिएशन अच्छी तरह से शोध नहीं किया गया है। एक हाल ही में वर्णित वैकल्पिक पद्धति है, जिसमें शाही सेना Seq इतनी के रूप में पूर्ण लंबाई सीडीएनए पूछताछ करने के लिए संशोधित किया गया था, पता चलता है दूर splicing घटनाओं अधिक सह निर्भर तुलना में पहले सोचा 42 हैं।
Stat3 एक दाता मिलकर ब्याह साइट में शामिल है। अपनाने मिलकर ब्याह साइटों अधिक लगातार 43 कर रहे हैं और उल्लिखित प्रोटोकॉल के सिद्धांतों NAGNAG splicing और 200 न्यूक्लियोटाइड के भीतर अन्य splicing घटनाओं के संयोग का पता लगाने के लिए assays के विकास के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा कर सकता है। अन्य पोतेनTiAl अनुप्रयोगों अन्य सूक्ष्म अनुक्रम मतभेद, indels या दो / तीन nucleotide बहुरूपताओं 44 तरह के संयोग की मात्रा का ठहराव शामिल हैं।
The authors have nothing to disclose.
P01HL088584: लेखक airway सूजन और remodeling में eosinophils की भूमिका पर कार्यक्रम परियोजना अनुदान के लिए स्वास्थ्य-NHLBI के राष्ट्रीय संस्थानों को स्वीकार करना होगा (पीआई: एन Jarjour), और विस्कॉन्सिन Carbone कैंसर केंद्र और चिकित्सा विभाग के विश्वविद्यालय अंदर का वित्त पोषण के लिए। हम चार Stat3 वेरिएंट क्लोनिंग के लिए डगलस Annis धन्यवाद।
MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
NheI | New England Biosciences | R0131S | |
SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |