دمج المطلق والنسبي البيانات الكمية PCR لتحديد STAT3 لصق النصوص البديل
Summary
Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and α/β C-termini, can be quantified.
Abstract
Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (ΔS) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (α) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (β). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3‘s four spliced transcripts (Sα, Sβ, ΔSα and ΔSβ) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants’ levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.
Introduction
قصيرة المدى (جنبا إلى جنب) الربط البديلة، حيث بديلة متقبل أو الجهات المانحة المواقع هي على مقربة من بعضها البعض، هو أمر شائع في الثدييات 1، 2 اللافقاريات والنباتات 3. وتشير التقديرات إلى أن 20٪ من جينات الثدييات تحتوي على مواقع لصق بديلة 2-12 النيوكليوتيدات عدا 4. العديد من هذه المواقع هي 3 النيوكليوتيدات، وبصرف النظر يؤدي إلى إدراج أو استبعاد كودون واحد. هناك جدل حول طبيعة تنظيم الربط في هذه المواقع 5،6 حيث رأى البعض أن الخلافات الربط عزر خفية بحيث الاختيار العشوائي 7، في حين الاستدلال الآخرين التنظيم على أساس خصوصية الأنسجة 8.
وقد تم تحليلها جنبا إلى جنب اختيار الموقع لصق شبه كميا باستخدام المعدلة الكهربائي الشعرية 7، وعالية الدقة هلام الكهربائي 8. RNA تسلسل (RNA تسلسل) يقرأ يمكن استخدامها لقياس نسب الربط في كل لصقموقع. في هذه الطريقة، وقد وفرت بيانات الحمض النووي الريبي يليها ثاقبة في تنظيم المواقع جنبا إلى جنب لصق 9. وقد مكن أيضا التنبؤ نسب البديل لصق المتوقع على أساس النوكليوتيدات عزر 10. أكثر من التركيز على الربط الذي يشمل أو يستثني كانت رامزة واحدة على تحدث أكثر شيوعا المواقع لصق جنبا إلى جنب متقبل، والمعروفة باسم NAGNAGs (حيث N = أي النوكليوتيدات).
جنبا إلى جنب المانحة المواقع لصق البديلة بما في ذلك أو استبعاد كودون واحد (GYNGYN الاعتراف عزر، حيث = Y بيريميدين) هي أقل شيوعا من يقبلون جنبا إلى جنب. محول الإشارات ومنشط النسخ 3 (STAT3) هو جين رئيسي تمر جنبا إلى جنب المانحة الربط البديل 1،11. المواقع لصق جنبا إلى جنب المانحة تنضم الإكسونات 21 و 22 و تؤدي إلى إدراج أو استبعاد رامزة لسيرين-701 (S أو ΔS على التوالي) 1،11. مواقع المصب بديلة متقبل (40 النيوكليوتيدات بعيدا عن بعضها البعض) الانضمام الإكسونات 22 و23A / ب نتيجة في إدراج إما 55 البقايا النهائية للمجال transactivation (α) أو مجال transactivation اقتطاع مع 7 بقايا C-محطة فريدة من نوعها (β) 11. ولذلك، أربعة أنواع لصق ممكنة.
البروتين STAT3 هو عامل النسخ وتكامل إشارة رئيسيا في العديد من أنواع الخلايا 12 وعندما تحور تفعيله التأسيسي يساهم في العديد من الظواهر السرطان (إعادة النظر في المرجع 13). متلازمة أيوب، اضطراب نقص المناعة تتميز بمستويات عالية من فريق الخبراء الحكومي الدولي، ويتسبب أيضا عن طريق الطفرات في STAT3 (إعادة النظر في المرجع 14). كانت أدوار متميزة للα STAT3 والبروتينات β لصق البديل سابقا ووصف 15. في البداية، كان يعتقد STAT3 β للعمل في المهيمنة سلبية على نحو 16 استعداء النشاط النسخي STAT3 α، ولكن اقترح العمل اللاحق لديها الجينات المستهدفة مستقلة 17 </sتصل>. وعلى الرغم من دقة من الربط جنبا إلى جنب، هناك سبب للاعتقاد بأن غياب أو وجود سيرين-701 وظيفة (Ser701) التأثيرات. ليس فقط هو Ser701 على مقربة من التيروزين-705 (بقايا فسفرته في تفعيل STAT3 18)، ولكن تشير دراسة حديثة أن STAT3 S وΔS المتغيرات لصق على حد سواء اللازمة لبقاء المدمنين STAT3 منتشر كبير خلية B الغدد اللمفاوية (DLBLCL) خلايا 19. وتبقى أهمية بيولوجية لاستكشافها. وبالنظر إلى أن تكوين لصق البديل يمكن أن تؤثر على وظيفة، سعينا لاكتشاف ما إذا كانت منزعجة نسبة من التحفيز خلوى في الحمضات.
لقد حاولنا في البداية لاستكشاف الربط بين الأحداث الربط اثنين باستخدام PCR محددة لα STAT3 والمتغيرات β لصق، تليها انشقاق من المنتجات مع تقييد انزيم معين لمتغيرات S لصق، AfeI. وأشارت كثافة من المنتجات إدراج كانت Ser701 صoughly عشر مرات أكثر شيوعا من حذفها (ΔS) في كل α STAT3 وβ (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، كان هذا النهج نصف الكمية لا يمكن استنساخه بما فيه الكفاية، ولا يمكن استخدامها بفعالية لقياس جميع لصق أربعة متغيرات في وقت واحد. تحليل نسب كل من الخيارين لصق أربعة، كان من الضروري وضع بروتوكول الكمي PCR (QPCR) التي أسفرت عن ضيق التقنية (عدة فحوصات لعينة معين) يعيد.
يعتمد النسبية QPCR على المقارنة بين الجينات التي تهم جين القياسية أو التدبير المنزلي المعروف أن أعرب في معين مستوى 20 ومناسب عندما يتم تضخيم هذا الجين من الفائدة والجينات التدبير المنزلي بكفاءة مماثلة. والذين تقطعت بهم السبل (س) فلوري (cyanine) صبغ مزدوج الحمض النووي ملزم يربط amplicons PCR 21، وبعد عدد معين من الدورات، حدث تضخيم كافية لمضان أن تكون قابلة للكشف. كلما ارتفع مستوى الأوليمن النص، وانخفاض دورة عتبة (CT) قيمة. حيث أن تركيز الاستعدادات كدنا] يختلف، ويحتاج المرء لمقارنة تركيز نص مع تركيز على نسخة من المعروف أن أعرب في مستوى ثابت في جميع العينات، مثل غلوكورونيداز-β (GUSB) في الحمضات 22.
النسبي QPCR ليس من الممكن لمتواليات مشابهة إلى حد كبير، كما رأينا في المتغيرات لصق الناتجة عن الربط جنبا إلى جنب. الشروط الصارمة المطلوبة لتضخيم تحديدا المتغيرات لصق تؤدي إلى كفاءة انخفضت. بدلا من ذلك، يجب استخدام الكمي المطلق 23. هذا يستلزم إعداد المنحنى القياسي مع تركيزات معروفة من نص تقسم المصالح، وضمان ظروف PCR تحسين النوعية 24. كما هو موضح، البيانات QPCR المطلقة والنسبية لجين معين يمكن دمجها لإبلاغ فهم تعبير الجين في نوع خلية معينة، فيهذه الحالة STAT3 في الحمضات حفز مختلفة 25.
هنا، يتم وصف STAT3 لصق البديل الكمي مع توقع أن الطريقة يمكن تكييفها لدراسات المستهدفة من الأحداث جنبا إلى جنب الربط الأخرى. كان تحسين عملية طويلة، حيث تم اختبار عدة أزواج التمهيدي في تركيزات مختلفة والعديد من التكرارات من المعلمات الدراجات على مدى بضعة أشهر. الملامح الرئيسية لبروتوكول هي التحقق من صحة خصوصية التمهيدي وتقدير على أساس المنحنيات القياسية مع تركيزات معروفة من المتغيرات لصق. QPCR النسبي بالتزامن ثبت مفيدة لطلبنا ولكن ليس من الضروري.
Protocol
Representative Results
Discussion
وضعنا هذا البروتوكول من أجل تقييم مستويات ونسب النصوص البديل STAT3 لصق في الحمضات والخلايا سرطان الغدد الليمفاوية ومعرفة ما إذا كانت التحفيز خلوى أثرت على مستويات وأبعاد. STAT3 غير ذات أهمية خاصة بسبب وظائفه عديد المظاهر وغير مؤكد، مع تقارير متضاربة حول ما اذا كان بمثابة oncoprotein أو القامع ورم في السرطان (إعادة النظر في المرجع 33). وقد أدت الاختلافات بين STAT3 α و β لصق البديل وظيفة تميزت سابقا 34،35، وبروتوكول لدينا سهل تدق إلى أسفل / إعادة التعبير التحليل الذي يشير إلى وجود الحاجة إلى النسبة المثلى من S وΔS النصوص 19.
سوف تقدير دقيق للمتغيرات لصق متميزة تسهيل مزيد من التحقيقات في وظيفة تتعلق STAT3 غير متجانسة للصق تكوين متغير. بروتوكول يدمج البيانات QPCR المطلقة والنسبية، والجمع بين قدرة أبالمذاب QPCR لحساب نسب لصق البديل، وQPCR النسبي لقياس التغيرات في التعبير STAT3 العام. هذا النهج يسمح احد لتمييز الفروق الدقيقة في تسلسل في وقت واحد قياس نسب الربط في موقعين لصق بديلة أكثر من 50 النيوكليوتيدات على حدة. تحديد نسب للأحداث الربط بشكل فردي لن يكون أسفرت عن استنتاج بارز أن وجدت وجود تحيز شارك في الربط هؤلاء أن مستويات ΔSβ أكبر مما كان متوقعا إذا استخدامات الموقعين وتقسم عشوائيا 25.
الأهم من ذلك، QPCR المطلق مع استخدام البلازميد منحنيات المعايرة تمكن الكمي (في الكفاءة دون المستوى الأمثل) من الاختلافات لصق التي تؤدي إلى تسلسل مشابهة إلى حد كبير. نتوقع رواية الربط خفية QPCR الفحص يجب أن تأخذ ما يقرب من شهرين على الوجه الأمثل. الخطوات الرئيسية في تطوير الاختبار هي إنشاء البلازميدات STAT3 المستخدمة في توليد المنحنيات القياسية لQPCR مطلقة؛ بتمرستحديد تسلسل التمهيدي الأمثل والمعلمات الدراجات لضمان خصوصية والتكاثر. ودمج البيانات QPCR النسبية مشتقة من قياس عموم STAT3 التعبير بالنسبة إلى التعبير GAPDH. العلاقة من عدد نسخ كميا من قبل عموم STAT3 مقابل الكمي التراكمي (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) يدل على أن بروتوكول ينتج نتائج يمكن الاعتماد عليها.
والتحذير من هذه التقنية هو عملية التحقق من الصحة واسعة النطاق. فمن الضروري لتقييم التباين داخل فحص (التكرار)، وتقلب interassay (استنساخ) وخصوصية. يحدد البروتوكول الطرق للحصول على المخرجات الرقمية لهذه المعايير. نحن اعتبرت كفاءة ≥75٪، عامل خصوصية ≥4، معامل الاختلاف (استنساخ) ≤10٪ وط الانحراف المعياري (التكرار) ≤0.2 العتبات مناسبة 30. والطفرات أو الحذف في تسلسل الأحماض الأمينية STAT3 1-690 لا تكون discoveأحمر من هذا البروتوكول، على الرغم من أنها قد تؤثر على نسب الربط. قد لا تكون نسب نسخة يتناسب مع proteoform نسب 36.
منذ عينات تختلف فيما بينها مبالغ تبدأ من إجمالي كدنا]، QPCR المطلق هو مناسبة لمقارنة أعداد نسخة من المتغيرات لصق ضمن عينة ولكن ليس للمقارنة بين عينة ما لم تقترن QPCR النسبي باستخدام الجينات التدبير المنزلي المعمول بها. وصف طريقة يتفق مع المبادئ التوجيهية MIQE QPCR لاستنساخ 30. قد تحتاج إلى تعديل للحصول على بيانات قابلة للتكرار إذا تم استخدام معدات أخرى المعلمات الدراجات PCR وتركيزات التمهيدي. مثالية خصوصية غير ممكن دون المساس بشكل كبير كفاءة، ولكن تم تضخيم الهدف بكفاءة أكبر من خلال أكثر من أربعة أوامر من حجمها.
يتم تضخيمه الخطي الحمض النووي أكثر سهولة من التعميم. إذا لم البلازميد بديل يوفر منحنيات معيار مرضية (R 2 <. 0.95)، والنظر في linearizing البلازميد التي كتبها تقييد موقع واحد قبل الكمي. تحسين QPCR أمر بالغ الأهمية للحصول على بيانات ذات نوعية جيدة (الشكل 1). معظم البروتوكولات QPCR تعتمد على خطوتين ركوب الدراجات، ويتم تحسين الآلات وفقا لذلك. يمكن أن تتفاقم غير موحدة تسخين كتلة التدفئة في ثلاث خطوات ركوب الدراجات، وأسهم في تدهور حالة التكرار. يجب تعيين فحوصات تحت ظروف معقمة مع نصائح مرشح ماصة والماء عالى النقاء، من الناحية المثالية في غطاء تدفق الصفحي مخصص. بسبب الملوثات يمكن أن يؤدي إلى نتائج غير متناسقة، وينبغي وضع المقايسات تحت ظروف معقمة مع نصائح مرشح ماصة والماء عالى النقاء، من الناحية المثالية في غطاء تدفق الصفحي مخصص. لمزيد من المعلومات حول QPCR الأمثل، والرجوع إلى Bustin وآخرون. 32
قياس STAT3 قد يؤدي إلى مزيد من التبصر في عدد من السياقات. STAT3 السيارات ينظم الخاص بها التعبير 37، والبروتوكول المذكورة أعلاه قد يساعدلتوضيح ما إذا كانت نسب المتغيرات لصق STAT3 تساهم في تنظيم هذه الحلقة ردود الفعل الإيجابية. يمكن استخدام البروتوكول لدراسة التحولات في نسب البديل لصق كما لوحظ في الخلايا عند اختلاف الكثافة 38 أو عبر مسار التنمية: من المعروف أن STAT3 التغييرات α / β نسبة في مستوى البروتين أثناء تكون الدم 16. ساندين وآخرون. وجدت أن واحدة النوكليوتيدات تعدد الأشكال الربط منحازة intronic من اكسون 12 في STAT3 للمريض يعانون من متلازمة أيوب 39. فمن المتصور أن واحدة من العديد من تعدد الأشكال الموجودة في إنترونات بين اكسون 21 و 22، أو اكسون 22 و 23 قد تسهم في نسب الربط من ΔS / S وα / β على التوالي. ويمكن استخدام الاختبار لتحديد النصوص STAT3 في الخلايا السرطانية، حيث طفرات أو تغيرات في تنظيم الربط قد يدخل التحيز لعملية الربط 40. طفرات في عوامل الربط (مثل SF3B1)، بصفة مراقبإد في متلازمة خلل التنسج النقوي 41 قد يؤدي أيضا إلى التغييرات التي يمكن أن يقاس هذا البروتوكول.
وعلى نطاق أوسع، وهذا النهج بالكشف عن تحديدا شارك في الجمعية في الربط، وهي ليست مجدية مع التقليدية RNA تسلسل، ولا QPCR القياسية. في حين أن ظاهرة الربط اكسون يتعارضان توضح تنسيق القرارات الربط، وشارك في جمعية أحداث الربط الأخرى لم-مدروسة جيدا. وهناك طريقة بديلة وصفها مؤخرا، والتي تم تعديلها RNA تسلسل وذلك لاستجواب كامل طول كدنا]، وتشير الأحداث الربط البعيد هي أكثر بالتشارك تعتمد مما كان يعتقد سابقا 42.
يحتوي STAT3 موقع لصق جنبا إلى جنب المانحة. متقبل المواقع جنبا إلى جنب لصق أصبحت أكثر تواترا 43 ومبادئ بروتوكول المبينة يمكن أن تكون بمثابة نقطة انطلاق لتطوير فحوصات للكشف عن تزامن NAGNAG الربط والأحداث الربط الأخرى في حدود 200 النيوكليوتيدات. الهياج الآخرينوتشمل التطبيقات المكاني الكمي للصدفة أخرى الخلافات تسلسل خفية، مثل indels أو مزدوجة / النوكليوتيدات الثلاثي 44.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف المعاهد الوطنية للصحة، NHLBI لمشروع برنامج المنحة على دور بالحمضيات في التهاب الشعب الهوائية وإعادة عرض: P01HL088584 (PI: N. جرجور)، وجامعة ويسكونسن مركز سرطان كاربوني وقسم الطب للحصول على تمويل جماعية. نشكر دوغلاس أنيس لاستنساخ المتغيرات STAT3 الأربعة.
Materials
| MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
| GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
| Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
| PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
| KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
| NheI | New England Biosciences | R0131S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
| Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
| NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
| GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
| Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
| Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
| EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
| ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
| pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
| QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
| DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
| kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
| Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
| Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
| Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
| Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
| Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
| Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |
References
- Hiller, M., et al. Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors. Genome Biol. 7 (7), R65 (2006).
- Treacy, M. N., et al. Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription. Cell. 68 (3), 491-505 (1992).
- Schindler, S., et al. Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes. BMC Genomics. 9, 159 (2008).
- Szafranski, K., Kramer, M. It’s a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing. RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).
- Wang, M., et al. Alternative splicing at GYNNGY 5′ splice sites: more noise, less regulation. Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).
- Hiller, M., Platzer, M. Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites. Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).
- Tsai, K. W., Lin, W. C. Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific. Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).
- Tadokoro, K., et al. Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products. J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).
- Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution. PLoS Biol. 10 (1), e1001229 (2012).
- Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse. RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).
- Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).
- Waitkus, M. S., et al. Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform. Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).
- Srivastava, J., DiGiovanni, J. Non-canonical Stat3 signaling in cancer. Mol Carcinog. , (2015).
- Holland, S. M., et al. STAT3 mutations in the hyper-IgE syndrome. N Engl J Med. 357 (16), 1608-1619 (2007).
- Maritano, D., et al. The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions. Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).
- Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation. Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).
- Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell. 108 (3), 331-344 (2002).
- Stahl, N., et al. Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors. Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).
- Zheng, M., et al. A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture. Oncogenesis. 4, 184 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
- Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils. Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).
- Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).
- Too, H. P. Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).
- Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells. PloS One. 10 (5), e0127243 (2015).
- Maurer, L. M., et al. Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes. J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).
- Ausubel, F. M., et al. . Current protocols in molecular biology. , (1987).
- Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).
- Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. The modified Beer-Lambert law revisited. Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45 (2001).
- Bustin, S. A. . A-Z of quantitative PCR. , (2004).
- Zhang, H. F., Lai, R. STAT3 in cancer-friend or foe. Cancers (Basel). 6 (3), 1408-1440 (2014).
- Caldenhoven, E., et al. STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).
- Zammarchi, F., et al. Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).
- Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
- Narimatsu, M., et al. Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells. Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).
- Szafranski, K., et al. Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).
- Sundin, M., et al. Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology. J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).
- Oltean, S., Bates, D. O. Hallmarks of alternative splicing in cancer. Oncogene. 33 (46), 5311-5318 (2014).
- Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes. Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).
- Tilgner, H., et al. Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events. Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).
- Hiller, M., et al. Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity. Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).
- Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).
