פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
האטיולוגיה ואת ההשפעות של חשיפה אנושית פתוגנים סביבתיים הם של דאגה גדולה ברחבי העולם, ובכך, את היכולת להעריך באמצעות חשיפה וזיהומים חסכוניות, גישות תפוקה גבוהה תהיה הכרחית. כתב יד זה מתאר את ההתפתחות וניתוח של immunoassay זמנית מבוסס חרוז ליכולת למדוד את הנוכחות של נוגדנים ברוק אדם פתוגנים רב בו זמנית. רוק הוא אטרקטיבי במיוחד ביישום זה בגלל זה אינו פולשני, זול יותר וקל יותר לאסוף מ בסרום. אנטיגנים של פתוגנים סביבתיים היו מצמידים את microspheres carboxylated (חרוזים) ומשמשים למדידת נוגדנים בנפחים קטנים מאוד של דגימות רוק אנושיים באמצעות assay מבוסס חרוז, פתרון פאזיים. חרוזים היו מצמידים עם אנטיגנים מ קמפילובקטר jejuni, הליקובקטר פילורי, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 ו- G II.4) ודלקת כבד נגיפית A וירוס. כדי להבטיח כי אנטיגנים היו מצמידים מספיק כדיהחרוזים, צימוד אושרו באמצעות נוגדני מינים ספציפיים, לכידה עיקרית-מחי, ואחריו דגירה עם נוגדני איתור משני אנטי-מיני biotinylated כתב streptavidin-R-Phycoerythrin (SAPE). כביקורת למדוד הלא ספציפי מחייב, סט חרוז אחד טופל באופן זהה לאחרים אלא שזה לא היה מצמיד את כל אנטיגן. האנטיגן מצמיד ובקרת חרוזי הודגרו אז עם דגימות רוק אנושיות-שנאספו פרוספקטיבית, נמדדו על נתח תפוקה גבוהה על בסיס העקרונות של cytometry זרימה, ואת הנוכחות של נוגדנים לכל אנטיגן נמדדה ביחידות עוצמות קרינה החציונית (MFI) . יש immunoassay זמנית זו מספר יתרונות, כולל נתונים נוספים עם מדגם פחות; עלויות עבודה מופחתות; ואת היכולת להתאים את assay מטרות רבות של עניין. תוצאות מחקר מראים כי immunoassay זמנית הרוק עשויה להיות מסוגל לזהות חשיפות וזיהומים קודמים, אשר יכול להיות especially שימושי במחקרי מעקב המעורבים אוכלוסיות אנושיות גדולות.
Introduction
שימונים ושמונה אחוזים של מחלה הקשורים שלשולים ברחבי העולם קשור לחשיפת אדם למים מזוהמים, מזון בטוח, והיגיינה / תברואה הירודה, גרימה כ -1.5 מיליון מקרי מוות, רובם הם ילדים 1. זהו גורם עיקרי לדאגה עבור אנשי בריאות ציבור וקובעי מדיניות. במאמץ לחקור חשיפות ומחלות הקשורות waterborne ופתוגנים סביבתיים אחרים, פיתחנו immunoassay זמנית למדוד נוגדנים בדגימות אדם 2-4. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אפידמיולוגיים לקבוע חשיפה אנושית פתוגנים אלה עדיף להגדיר זיהומי immunoprevalence ואירוע.
רוק טומן בחובו הבטחה ניכרה כחלופת סרום המחקר ביו-מרקר אדם. בין היתרונות של שימוש רוק הם-הפולשנות הלא וקלות אוסף מדגם, בעלות נמוכה, ודוגמאות ניתן לאסוף בקלות מילדים 5-7 </ Sup>. סרום דגימות רוק נחקרו רבות עבור נוגדנים כנגד H. פילורי 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, דלקת ריאות סטרפטוקוקוס 12, וירוסים הפטיטיס A ו- C 13-14, noroviruses 2-4,15, ט גונדי 2-4, דנגה וירוס 16, וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) 17, ו Escherichia coli O157: H7 18.
Immunoassay זמנית מאפשר ניתוח של analytes מרובים בו זמנית בתוך נפח דגימה אחת ותוך מחזור אחד או לרוץ. אנטיגנים Multiplexed מ ג jejuni, ט גונדי, H. pylori, הפטיטיס וירוס, ושני noroviruses שמש למדידת אדם רוק IgG 2-4 ו IgA 3,4 ופלזמת תגובות 2,3 נוגדן IgG לפתוגנים אלה באמצעותחרוז מבוסס ריבוב immunoassay. הפועל בשיתוף עם מחקרים אפידמיולוגיים של חשיפה לחיידקים במים, אדמה ומזון, הסוג של assay המתואר במחקר זה עשוי לספק מידע רב ערך על מנת לשפר את ההבנה של זיהומים הנגרמים על ידי פתוגנים סביבתיים. יתר על כן, נתוני נוגדן רוק שהתקבלו ממחקרים כאלה יכולים לשמש כדי לשפר את המודלים להערכת סיכוני 19-22.
Protocol
Representative Results
Discussion
תוצאות אלו מצביעות כי השיטה immunoassay זמנית שימושי להפלות בין דגימות רוק כי הם immunopositive או immunonegative. כדי לקבוע immunopositivity, נקודה אחת חתוכים פותחה על ידי חישוב הממוצע פלוס שלוש סטיות תקן מן תגובות MFI טרנספורמציה יומן של החרוזים המלאים הזוגיים נבדקו עם כל דגימות הרוק. הנקודה ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
References
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. . Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , (2008).
- Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
- Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
- Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
- Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
- Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
- Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
- Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
- Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
- Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
- Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
- Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
- Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
- Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
- Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
- Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
- Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
- Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
- Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
- Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
- Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
- Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
- Wade, T. J., et al. . Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
- Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
- Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
- Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
- Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
- Clotilde, L., Bernard, C., Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
- . . Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
- Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).
