Summary

Бедро Window камера Модель<em> В Vivo</em> Отслеживание Cell в мышиных костного мозга

Published: July 28, 2016
doi:

Summary

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Abstract

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Introduction

Костный мозг является важным органом участвует в кроветворении и регуляции иммунной системы. Он состоит из компонента , содержащего кроветворной гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) и стромальных компонент , содержащий не-кроветворных клеток – предшественников , которые приводят к мезенхимальных клеток 1. Две трети кроветворной деятельности посвящена поколению миелоидных клеток 2. В частности, большое количество нейтрофилов в костном мозге, при 1-2 х 10 11 клеток , полученных в день в нормального взрослого человека 2. Нейтрофилы являются первой линией защиты от микробной инфекции и в основном сохраняются в костном мозге , пока стресс не вызывает их мобилизацию в дополнение нейтрофилов периферической 1,3. В дополнение к их антимикробных эффектов, недавние исследования указывают на важную роль нейтрофилов в биологии рака, имеющие как про- и анти-онкогенными фенотипы в зависимости от роста преобразующейКоэффициент бета (TGF-β) сигнализации в опухоль микроокружения 4,5. Кроме того, исследования показали , что нейтрофилы , которые накапливаются в первичных опухолях оказывают про-онкогенных и метастатических эффекты путем подавления цитотоксическую функцию Т – клеток 6,7, в то время как нейтрофилы в обращении оказывают цитотоксическое, антиметастатическую эффект 8. Таким образом, исследование гемопоэтических клеток в костном мозге, в частности нейтрофилах, имеет решающее значение для их выяснении роль в иммунной и опухолевой регуляции.

Гистологическое и полный периферийный анализ крови , которые обычно используются для оценки клеточных и структурные изменения в костном мозге 9. Тем не менее, эти методы обеспечивают только статическую информацию о различных клеточных популяций или микроструктур тканей. Продольный в естественных изображений могут быть использованы в сочетании со стандартными методами с целью оценки динамики нескольких клеточных, сосудистых и стромальных компонентов, а также от клетки к CELL взаимодействия в продольном образом. Прижизненные микроскопии (IVM), определяется как визуализации живых животных при микроскопическом разрешением 10, является особенно полезным для оценки динамических клеточных процессов , в течение долгого времени в том же самом образце, уменьшая количество экспериментальных животных требуется. IVM часто сочетается с хронически пересаженной окна камеры (WC), чтобы получить доступ к органу интереса для визуализации в течение периода от нескольких недель до месяцев. Черепных и спинных-складка WC модели имеют самую длинную историю использования, начиная с середины 1990-х годов. Совсем недавно другие органоспецифические WC модели , такие как таковые из жировой ткани молочных желез и различных органах брюшной полости, были разработаны 11.

Типичный подход для визуализации костного мозга в естественных условиях имеет в основном вовлечены воздействие на своде черепа мышей, где утонченная кости позволяет осуществлять прямую визуализацию отдельных клеток с минимальным хирургическим вмешательством 12-14. Тем не менее, свода черепа костный мозг может бе отличие от других костей, таких как длинной кости, как продемонстрировано меньшим количеством HSPCs и гипоксических клеток в своде черепа, что свидетельствует сокращает расходы на содержание и развитие HSPCs 15. Таким образом, альтернативные подходы для оценки клеточных компонентов в длинной кости были исследованы. К ним относятся прямое облучение костного мозга бедренной кости 16 и внематочной трансплантация разделенной бедренной кости в дорсальной кожной складки WC 17. Тем не менее, первый является терминал процедура, которая не позволяет отслеживать клеточных, структурных и функциональных изменений в течение более длительных периодов времени, и последний, вероятно, нарушает нормальную функцию костного мозга из-за трансплантацией бедренной кости к внематочной месте внутри спинной кожной складки WC. Другой метод, который позволяет ортотопической последовательного визуализации костного мозга бедренной кости в течение долгого времени является использование туалета в бедренной кости. Один предыдущий доклад продемонстрировал долгосрочный визуализации микроциркуляции в костном мозге бедра с использованиембедренной кости туалет у мышей 18. Кроме того, авторы продемонстрировали визуализацию опухолевых клеток в бедренной кости, что указывает на его полезность в деле мониторинга костного метастаза мозга. Тем не менее, эта конструкция WC был ограничен его большой размер (диаметр 1,2 см) и относительно небольшой площади изображения (4 мм в диаметре), который подходит только для больших мышей (26-34 г, в 3-6-месячном возрасте), тем самым делая подход непрактичным для повседневного использования.

Таким образом, новый туалет с меньшим общим размером и большей площади внутренней обработки изображений был разработан для целей настоящего исследования. Цель данного исследования состояла в том, чтобы обеспечить способ для визуализации различных типов клеток в костном мозге бедра. Модель WC бедренной кости была разработана в доме и был использован для визуализации и отслеживания нейтрофилов в 3D сосудистой сети. С помощью этой модели ИВМ костного мозга может быть выполнена последовательно в течение 40 дней. Этот подход может быть применен к различным полей для выяснения процессов кроветворения, иммунной регуляцииразвитие опухоли й.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все для животных работа была проведена по протоколу # 2615, утвержденным Institutional уходу и использованию животных комитета университета сеть здравоохранения путем. 1. Хирургическая подготовка мыши До операции стерилизации все хирургические инструменты и окно камеры …

Representative Results

Murine femoral bone marrow is successfully accessed using the WC to enable visualization of individual neutrophils and vascular networks. Figure 1 shows the WC instrument and describes the surgical procedure, which involves exposure of the femoral bone and thinning of cortical bone to gain optical access inside the bone. The surgery is well-tolerated in mice; they were assessed for adverse physical reactions, such as hind limb swelling, non-weight bearing on limb, self-mu…

Discussion

Real-time, serial imaging of the dynamic cellular processes in bone marrow provides information that is otherwise challenging to obtain using conventional techniques such as histology and total blood counts. The femur WC model described here provides unique opportunities to investigate cellular and structural alterations in the bone marrow over time. Although a femur WC model has been previously reported, our novel design provides a larger imaging field of view and smaller overall WC size, which are more compatible for u…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank the Advanced Optical Microscopy Facility (www.aomf.ca) at the University Health Network for assistance with microscopy, and Mr. Jason Ellis from the Princess Margaret Cancer Center Machine Shop for manufacturing the WC and the imaging stage. We would also like to thank Dr. Iris Kulbatski for manuscript editing.

Materials

NRCNU-F athymic nude mice Taconic Ncr nude 8-10 weeks old, female
Saline Baxter JB1302P
Ketamine hydrochloride Bioniche Animal Health Canada, Inc.  DIN 01989529
Xylazine Bayer HealthCare, Bayer Inc. DIN 02169592
Surgical drape Proxima DYNJP2405
Electric heating pad Life Brand 57800827375
Stereomicroscope Leica Leica M60
Eye ointment (tear gel) Novartis  T296/2
7.5% betadine Purdue Frederick Co 67618-151-16
70% isopropyl alcohol GreenField P010IP7P
10% betadine Purdue Frederick Co 67618-150-05
Scalpel handle (#3) Fine Science Tools 10003-12
Scalpel blade (#15) VWR 89176-368
Spring Scissors curved Fine science Tools 15023-10
Baby-Mixter Hemostat Fine science Tools 13013-14
Fine Scissors Fine science Tools 14094-11
Extra Fine Graefe Forceps Fine science Tools 11151-10
Halsted-Mosquito Hemostats Fine science Tools 13008-12
Micro-drill Harvard Apparaus 72-6065
Micro-drill burrs Fine Science Tools 19007-14
Femur window chamber PMCC machine shop custom design 9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)
U-shaped bar PMCC machine shop custom design 13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)
Coverglass (8mm) Warner Instruments  HBIO 64-0701 CS-8R
Retaining ring (8mm) ACKLANDS GRAINGER UNSPSC # 31163202
Nuts (hexagon stainless steel) Fastenal 70701
Dental cement 3M RelyX U200
Suture (5-0 Monosof black) Covioien SN-5698
Halsey needle holder Fine Science Tools 12501-13
Buprenorphine (Temgesic) Reckitt Benckiser DIN 0281251
Meloxicam (Metacam) Boehringer Ingelheim DIN 02240463
Amoxicillin (Clamavox) Pfizer DIN 02027879
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)  eBioscience 17-9668
Two-photon microscope LSM 710 Carl Zeiss Zeiss LSM 710 NLO
Imaging stage PMCC machine shop custom design 15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)
Imaris software Bitplane Imaris 8.0 Image analysis software described in Section 3 of the Protocol 
Zen 2012 Zeiss Zen 2012 Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol 

References

  1. Zhao, E., et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).
  2. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  3. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
  4. Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. Tumor-associated neutrophils: friend or foe?. Carcinogenesis. , (2012).
  5. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: ‘N1’ versus ‘N2 TAN. Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).
  6. Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).
  7. Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
  8. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).
  9. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).
  10. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging. IntraVital. 3 (2), e29917 (2014).
  12. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. (96), e52476 (2015).
  13. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1. J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).
  14. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683 (2014).
  15. Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
  16. Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).
  17. Balan, M., Kiefer, F. A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs. IntraVital. 4 (2), e1066949 (2015).
  18. Hansen-Algenstaedt, N., et al. Femur window–a new approach to microcirculation of living bone in situ. J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).
  19. Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296 (2011).
  20. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  21. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  22. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  23. Bucher, K., et al. Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice. J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).
  24. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  25. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), (2013).
  26. Koewler, N. J., et al. Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur. J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).
  27. Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
  28. Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
  31. Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M., Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 289-312 (2014).

Play Video

Citer Cet Article
Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow. J. Vis. Exp. (113), e54205, doi:10.3791/54205 (2016).

View Video