더블 형광 결합<em> 현장에서</em> 마우스 뇌 섹션에서 세 가지 유전자의 발현의 검출을위한 Immunolabelling와 하이브리드
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
뇌 세포 등 뉴런, 아스트로 사이트, 올리고 덴드로 사이트, 희소 돌기 아교 세포 전구체와 미세 아교 세포의 종류에 유전자 발현의 검출은, 면역 특이 일차 또는 이차 항체의 부족에 의해 방해 될 수있다. 여기에서는 제 유전자에 의해 코드되는 단백질에 대해 지시 높은 특이성 항체로 면역 염색 한 다음 두 개의 유전자 특이 적 프로브 계내 혼성화 더블 형광을 사용하여 같은 뇌 섹션 세 가지 유전자의 발현을 검출하는 프로토콜을 기술한다. Aspartoacyclase (ASPA) 유전자의 돌연변이가 드문 인간의 백질 질환으로 이어질 수 – Canavan 질환은 – 희소 돌기 아교 세포 및 미세 아교 세포에 있지만 성상 세포 및 신경 세포에서 발현되는 것으로 생각된다. 그러나, 뇌에서 ASPA의 정확한 발현 패턴이 확립되어야한다. 이 프로토콜은 ASPA 성숙 희소 돌기 아교 세포 (a)의 부분 집합으로 표현되어 있는지 결정하기 위해 우리를 허용 한ND는 일반적으로 유전자 발현 연구 패턴의 넓은 범위에 적용될 수있다.
Introduction
중추 신경계 (CNS)에서 가장 풍부한 세포 인 아교 세포, 희소 돌기 아교 세포 (CNS의 myelinating 세포), 올리고 덴드로 사이트 전구체 (또한, "NG2 세포"라고도 OPS), 성상 세포 및 미세 아교 세포를 포함한다. 신경 질환 1 아교 세포의 잠재적 역할의 기능에 관심이 증가하고있다. 예를 들어, Canavan 질환 (CD)는 일반적으로 나이 2,3 10 년 전에 사망에 이르는 초기 해면상 leukodystrophy과 뉴런의 진보적 인 손실과 초기 단계에서 시작하는 유전 신경 퇴행성 질환이다. 리드 Aspartoacyclase (ASPA) 유전자의 돌연변이가 크게 CD에 ASPA 활동 (4)를 감소하기 위해이 확인되었다. ASPA는 N-acetylaspartate (NAA)의 탈 아세틸 화를 촉매 작용하는 효소, 높은 뇌에서 농축 분자 생성 아세테이트 및 아스파 5-7이다. 많은 CD 환자 인해 ASPA 교류 부족 NAA 높은 수준을 보여tivity. 일부 연구 NAA 파생 아세테이트 개발 과정에서 지방산 / 뇌 지질의 주요 원인이 될 수 있고 -3,5,6- 세분화 할 NAA의 실패로 인한 개발 기간 동안 수초 합성을 감소에서 CD가 발생할 수 있음을 추측.
ASPA는 주로 뇌의 신장, 간, 흰색 만에 발견하고, CD에 ASPA의 중요한 역할을 주어 뇌에서이 효소의 세포 발현은 여러 실험실에 의해 연구되고있다. 뇌의 ASPA의 효소 활성을 조사하여 이전 연구는 두뇌 개발하는 동안 ASPA 활동의 증가가 수초 8 ~ 10 시간 과정 평행 한 것으로 나타났습니다. 세포 수준에서 효소 활동뿐만 아니라 현장 하이브리드 (ISH) 및 면역 조직 화학 (IHC)의 분석은 ASPA는 주로 뇌에 있지만 뉴런 또는 성상 세포 11-16에서 희소 돌기 아교 세포로 표현하는 것이 좋습니다 분석. 몇몇 연구는 발견 ASPA는 수도중추 신경계 (12, 14)의 미세 아교 세포에서 발현 될 수있다. OPS에서 ASPA 식에 지금까지 데이터는 제한되어 있습니다. 신경 세포, 성상 세포, OPS, 새로 형성된 희소 돌기 아교 세포, myelinating 희소 돌기 아교 세포, 미세 아교 세포, 내피 세포 및 혈관 주위 세포를 포함하는 마우스 대뇌 피질의 다른 세포 유형의 전 사체는 RNA 시퀀싱 (17)에 의해 분석 하였다 최근의 연구에 따르면, ASPA는 독점적으로 희소 돌기 아교 세포로 표현된다 , 희소 돌기 아교 세포를 myelinating에서 특히 (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). 뇌의 ASPA 발현 패턴이 연구에도 불구하고, 불확실성이 남아있다.
다른 기술은 유전자 발현 패턴을 연구하는데 사용될 수있다. IHC는 조직 절편의 유전자 발현 기능성 제품 (즉, 단백질)을 검출하기위한 일반적으로 사용되는 방법이다. 해당 응용 프로그램과 특이성이 될 t만큼의 큰 유틸리티에도 불구하고,이 기술은 한계가있다필요한 항체의 가용성 특이 O. 대조적으로, ISH는 mRNA의 수준에서 어떤 유전자의 발현을 표시 할 수 있다는 이점을 갖는다. 그러나, 특정한 세포 유형으로 유전자 발현을 지역화 위하여 동시에 여러 개의 프로브를 사용하는 것이 기술적으로 어려울 수있다. 이 글에서, 우리는 단백질의 형광 immunolabelling와 현장 하이브리드 이중 형광 RNA를 결합하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 마우스 뇌 ASPA의 발현 패턴을 조사하는 기술이 세트를 사용 해왔다. 이 방법은 공 촛점 현미경을 사용하여 유전자 발현의 정확한 연구를 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 면역 염색 한 다음 현장 하이브리드의 이중 RNA에 대한 단계별 절차를 제공합니다. 우리는 ASPA 여러 뇌 영역에서 성숙한 희소 돌기 아교 세포에서 발현되는 것을 확인하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다.
이러한 다단 과정은 감도 영향을 미칠 수 있으므로 피해야한다 함정 많은 가능성이있다. 먼저, 전사 반응을위한 모든 솔루션 및 저장 버…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D’Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
