Summary

Intra-tracheale Amministrazione<em> Haemophilus influenzae</em> In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Published: March 02, 2016
doi:

Summary

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Abstract

Qui, descriviamo una procedura dettagliata in modo efficiente e fornire direttamente Haemophilus influenzae attraverso le vie respiratorie inferiori di topi. Dimostriamo la procedura per la preparazione H. influenzae inoculo, instillazione intra-tracheale di H. influenzae nel polmone, raccolta di liquido di lavaggio bronco-alveolare (BAL), l'analisi delle cellule immunitarie nel BAL, e l'isolamento di RNA per differenziale analisi di espressione genica. Questa procedura può essere utilizzata per studiare la risposta infiammatoria polmonare a qualsiasi batteri, virus o funghi. instillazione tracheale diretta è per lo più preferito su procedure intranasale o inalazione di aerosol in quanto fornisce in modo più efficiente l'inoculo batterico nel tratto respiratorio inferiore, con meno ambiguità.

Introduction

L'infiammazione è un meccanismo immunitario fondamentale di difesa contro gli agenti infettivi. Promuove eradicazione e la riparazione dei tessuti danneggiati patogeno. Inoltre facilita il recupero ad un normale stato di salute 1. Tuttavia, l'infiammazione disregolato spesso porta a malattie infiammatorie croniche 2. Infiammazione delle vie aeree è un trigger iniziale per diverse malattie polmonari come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), asma e fibrosi polmonare 3.

L'Haemophilus influenzae non tipizzabile (non incapsulata) (NTHi) è associata a malattie infiammatorie superiori ed inferiori polmonari croniche 4,5. E 'la specie dominante isolati dalle vie aeree inferiori di bambini e adulti con cronica ostruttiva 4,6,7 malattia polmonare. La risposta infiammatoria dopo l'infezione NTHi è caratterizzata dalla sovraregolazione di citochine proinfiammatorie (come TNF e IL-1β), ed è mediata by mitogeno proteina chinasi attivata (MAPK) e fattore nucleare-kB (NF-kB) attraverso i recettori Toll-like (TLR) 8.

Modelli murini sono strumenti molto utili per analizzare la patologia sottostante del polmone malattia infiammatoria a causa della disponibilità di diverse linee gene-carenti. Diversi metodi sono stati utilizzati per inoculare batteri vivi attenuati / e prodotti batterici, tra intranasale instillazione e aerosolized 9,10 inalazione. Qui, dimostriamo intra-tracheale instillazione. Sebbene utilizzato meno frequentemente, questo approccio è più efficace e altamente riproducibili a causa della consegna diretta dell'inoculo al tratto respiratorio inferiore.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) del Baylor Research Institute. 1. Coltura non tipizzabile Haemophilus influenzae (NTHi) e preparazione del Inoculo Piatto NTHi su una piastra di agar cioccolato e mantenere la piastra capovolta in un umidificata CO 2 incubatore notte a 37 ° C e 5% CO 2. Il giorno seguente, la cultura i batteri in brodo Brain Heart Infusion…

Representative Results

Instillazione intra-tracheale provocato un marcato aumento del numero di leucociti nel BALF (Figura 1A, pannello di sinistra) di installazione con soluzione salina. L'analisi conteggio differenziale dei leucociti mostrato chiaramente migliore infiltrazione dei neutrofili (Figura 1, pannello di destra). L'analisi FACS delle cellule nel BALF confermato ulteriormente l'aumento del numero di neutrofili (Figura 1B). L'analisi …

Discussion

Qui, si descrive una procedura unica e minimamente invasiva per inoculare i polmoni di topi con un agente patogeno batterico ai polmoni. Abbiamo dimostrato che questa procedura può essere utilizzata per studiare la funzione di geni differenti utilizzando topi che sono carenti di geni di vie di segnalazione infiammatorie. Questa procedura può anche essere usato per studiare le risposte infiammatorie alle infezioni polmonari virali e fungine. I vantaggi di questo procedimento rispetto ad altri metodi come intranasale o …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.

Materials

Chocolate agar plate Fisher Scientific CAS50-99-7
Dextrose Anhydrous Themo Scientific R01300
Heparin Hospira,Inc RL-3010
Deft quick solution Sigma GS500-500ML
Syringe needle 20/26G  BD (REF305115/175)
Iml syringe BD REF 309602
Catheter 20GA BD REF 381433
Dissecting Scissors, straight, 10 cm long kentscientific INS600393
Iris Forceps, serrated, 10cm long kentscientific INS650915
Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long kentscientific INS600095
10% Formalin Fisher Scientific CAS 67-56-1
Agarose peqlab 35-1020
5ml polystyrene round-bottom tubes BD REF 352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes Light Labs A-7001-R
Reasy Mini  kit  Qiagen 74104
Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) Sigma Z359971-1EA
96 well microtiter plates V bottom Thermo 2605
1X PBS Gibco 10010-023
OneComp eBeads eBioscience 01-1111-42
CD45.2-APC eBioscience 17-0454-81 Working dilution 1:100
Ly-6G-eFlor 450 eBioscience 48-5931-82 Working dilution 1:100
BSA HyClone SH30574.03
RBC Lysis Buffer (10X) Biolegend 420301
Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L-34957
EDTA (0.5M) lifetechnologies 15575-020
CD16/CD32 FcBlock BD 553142
Facs tubes polystyrene round bottom tube BD 352052
Formaldehyde Polyscience 4018

References

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Citer Cet Article
Venuprasad, K., Theivanthiran, B., Cantarel, B. Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation. J. Vis. Exp. (109), e53964, doi:10.3791/53964 (2016).

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