Summary

Murin Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon ve Kemik İliği İzolasyonu

Published: April 14, 2016
doi:

Summary

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Abstract

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Introduction

The study of long bones and the cells of the bone marrow is central to a myriad of research disciplines, including, but not limited to, bone biology, cancer biology, immunology, hematology, and biomechanics. The bone is a highly dynamic organ that together with the cartilage forms the skeleton to provide mechanical support against loading and protection of the internal organs. In addition, the mineral components of bone are a storage sink for the critical signaling molecules calcium and phosphorus, as well as other factors1. Finally, bones house the bone marrow and, together with metabolically active bone forming osteoblasts and bone resorbing osteoclasts, provide the stem cell niche necessary for the maintenance of hematopoietic and lymphoid cell populations.

Bone and bone marrow are affected in many disorders, often leading to bone marrow dysfunction, severe bone pain, and pathologic fracture. Bone is a common site of metastasis in many solid tumors, most notably breast cancer and prostate cancer, where tumor cells directly engage the bone marrow niche to initiate the vicious cycle of bone metastasis and displace hematopoietic stem cells2,3. Hematopoietic malignancies including myeloma and leukemia are characterized by bone marrow dysfunction as well as deregulation of healthy bone remodeling1. Other non-malignant skeletal disorders are also active areas of research, such as osteoarthritis, osteoporosis, scoliosis, and rickets. Even in an otherwise healthy individual, biomechanical failure in a bone leads to a painful fracture. All of these disorders represent active areas of research with the goal of identifying new preventative measures and treatment regimens to reduce morbidity and mortality.

To research the plethora of roles of the bone and the bone marrow, both under physiologic and pathologic conditions, it is critical for researchers to have a simple and efficient standardized method for dissection of the mouse long bones for rapid processing of large in vivo experiments. The dissection protocol outlined here is suitable for all long bone analyses including ex vivo imaging, histology, histomorphometry, and strength testing, among others. Similarly, a standardized bone marrow isolation method with high bone marrow cell recovery and low inter-user variability is important for experimental analysis such as fluorescence-activated cell sorting (FACS) or quantitative PCR (qPCR) as well as downstream applications such as primary cell culture of bone marrow cells.

Protocol

Tüm hayvan çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen tavsiyeleri doğrultusunda Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. 1. Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon kurumsal kurallara uygun olarak fare Euthanize. Bir yatar pozisyonda fare yerleştirin ve ayak bileği ekleminin altında fare pençe yastıkları sayesinde dört bacağı iğneleyerek yapıştırın. iyice bacaklarını dousing,% 70 etanol ile fare püskürtün. Sadece kalça üzerinde, alt karın bölgesinde orta hatta sağa doğru küçük bir kesi yapmak. bacak aşağıya ve ayak bileği ekleminin geçmiş kesi uzatın. Cildi geri çekin ve kurulu 45 derecelik bir açıyla pimi yerleştirerek, femur ön tarafını ortaya çıkarmak ve bacak dışarı pin femur proksimal ucuna demirlemiş kuadriseps kas kesti. blad ilefemur arka tarafına karşı makas e uzak diz ekleminden hamstrings kesti. kurulu 45 derecelik bir açıyla pimi yerleştirerek, cilt ve femur arka tarafını ortaya çıkarmak ve bacak dışarı pin femur proksimal ucuna demirlemiş hamstring kasları geri çekin. forseps ile, sadece diz ekleminde üzerinde, femur distal ucunu tutun. femur kendi içine kesmek için dikkatli olmak, kalça ekleminin doğru femur şaft iki tarafında makas bıçakları rehberlik eder. hafif açarak makas ile gösterilen femur başı, ulaştıktan sonra, femur başı aşağıda kemik snap dikkatli olmak, femur yerinden femur başının üzerine doğrudan hareketli makas üst bıçak ile makas bükün. , Forseps ile femur şaft üstünü tutun asetabulumun ayırmak için uzak femur başı yumuşak doku kesti. dahil olmak üzere tüm bacak kemiği çekinfemur, yukarı ve vücuttan uzak diz, ve tibia, özenle bağ dokusu kesip atmak ve kas cilde bacak bağlamak. tibia yerinden bir büküm hareket makas kullanmak tekrar ayak bileği eklemini overextend ve. özen, tibia distal ucunu kavrama, tendonları sever yukarı ve vücuttan ve pin kurulu tibia çekmeye değil. dizden fare uzun kemik takılması kalan Bağ dokusu kesin. herhangi bir ek kas veya femur tibia ve bağlı bağ dokusu çıkarın. Kemik gerektiren herhangi bir uygulama bozulmamış (vb histoloji, histomorfometri, biyomekanik test.) Kalması için, (4-7 gibi), standart in-house protokolleri ile devam edin. kemik iliği izole etmek, 2. bölüme geçin. 2. Uzun Kemik Hazırlık Kemik İliği İzolasyon forseps kullanarak, patella uzak bir bakacak femur kavramaknd proksimal ucu (femur başı) aşağı. Diz eklemini overextend ve tibia yerinden ve femur bir büküm hareket makas kullanın. Birlikte femur ve tibia tutan herhangi bir bağ dokusu kesti. forseps kullanarak dönük ön tarafında proksimal ucunda (femoral baş ucu) aşağı femur kavramak. kondillerin femoral şaft makas yukarı Kılavuzu. Yavaşça kondilleri, patellanın kaldırmak için ileri ve geri makas döndürmek ve epifiz metafizi ortaya çıkarmak. herhangi bir ek kas veya forseps, makas, ve Kimwipes kullanarak femur bağlı bağ dokusu çıkarın. forseps kullanarak dönük ön tarafı ve distal ucu (ayak bileği sonu) aşağı kaval kavramak. tibia epifiz sağlam ise, kondillerin için tibia şaft kadar makas rehberlik. Yavaşça kondilleri kaldırmak için ileri ve geri makas döndürmek ve epifiz metaph maruzSalman kararı. herhangi bir ek kas veya forseps, makas, ve Kimwipes kullanarak tibia bağlı bağ dokusu çıkarın. 3. Kemik iliği İzolasyonu 0.5 ml mikrosantrifüj tüp altından geçerek 18 G iğne itin. tüpe (2 femur ve 2 tibia'daki maksimum) uzun kemikleri koyun, diz sonu down bitirmek ve kapağı kapatın. Yuva, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü. 15 saniye boyunca bir mikrosantrifüj içinde ≥10,000 xg'de iç içe geçmiş tüpler santrifüjleyin. Kemik iliği görsel muayene ile kemiklerin dışarı bükülmüş olduğunu doğrulayın. kemikler, beyaz görünmelidir ve büyük tüp büyük bir görsel pelet olmalıdır. kemiklerle 0.5 ml'lik ependorf tüp atın. Uygun çözelti içinde kemik iliği (örneğin, PBS, kültür ortamı, FACS tamponu) ve deneysel protokol (DNA RNA ya da protein izolasyon devam AskıyaFACS analizi veya birincil hücre kültürü).

Representative Results

Burada açıklanan protokol kemik dokusunun zarar minimum fare femur ve tibia hızlı diseksiyon için optimize edilmiştir. Ve histoloji (Şekil 1C) 4,7 – Bu teknik biyomekanik çalışmaları, histomorfometri (B Şekil 1 A) dahil olmak üzere alt analiz, bir dizi için uygundur. Örnek histomophometric micoCT 3D rekonstrüksiyonu (Şekil 1A – Oda) süngerimsi kemik ve kortikal kabuk hem trabeküler sayı, kalınlık ve boşluk da dahil olmak üzere, kemik histomorfometrisi için standart yapısal parametrelerin doğru sayılmasını sağlayan ileri sürmüştür olduğunu göstermektedir; kemik hacmi; diğer önlemler 8 arasında ve kortikal kalınlık. Temsilcisi histolojik bölüm, bir H & E lekeli formalin ile fikse ve dekalsifiye tibia (Şekil 1C) gösterir. Görüntü kalsifiye b hem bütünlüğünü göstermektediron ve histolojik analiz için hücresel kemik iliği. kemik iliği izolasyon prosedürü, kemik iliği alanı sterilite koruyan kirlenmeyi azaltmak için düşük bir işleme sahiptir ve bu nedenle, kemik iliği verim kaybının azaltılması, uzun bir kemik kesimi gerektirmez. Bu kemik iliği 5 ve PCR analizleri akış sitometrisi dahil olmak üzere birçok alt uygulamalar için uygundur. 4,6 – Buna ek olarak, bu işlem osteoklastlar ve osteoblastlar (B Şekil 2A) gibi kemik iliği hücreleri, primer hücre kültürü için, kemik iliği ayırmak için kullanılabilir. (A) dış kortikal kabuk ve gösteren bir fare tibia Şekil 1. Histomorfolojik ve Fare Uzun Kemik histolojik Analizleri. Üç boyutlu MikroBT'lerin rekonstrüksiyon (B </s trong>) trabeküler kemik (Ölçek çubuğu = 0.5 mm). Bir sertliği alınmış ve kesitli tibia (4x) (C) histolojik H & E boyama. Görüntüler Katherine Weilbaecher Tıp, ABD Washington Üniversitesi nezaket. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Osteoklast ve osteoblastlar Ayrımında için Şekil 2. Primer Kemik İliği hücre kültürü. Osteoclastogenic medya (4x) 'de 7 günden sonra çok çekirdekli osteoklastlar için (A) TRAP boyaması. (B) osteoblast ve osteojenik medyada 21 gün sonra mineralizasyonu için alizarin kırmızı (kırmızı renk) leke Alkali fosfataz (mor renk). Katherine Weilbaecher görüntüleri nezaket Tıp, ABD Washington Üniversitesi.iles / ftp_upload / 53936 / 53936fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

We present a simple and efficient method for removal of mouse hind long bones and subsequent bone marrow isolation. This method maintains the high structural and cellular integrity of the bones and bone marrow and has low handling time, minimizing the likelihood of user-induced fracture or bone scoring that may influence downstream analyses. In addition, the centrifugation method for isolating bone marrow does not require cutting the bone to expose the bone marrow space or fluid to flush the bone marrow, reducing potential points of contamination. Moreover, the centrifuge technique is relatively high-throughput with lower hands-on time than other methods, thus reducing processing time.

High variation is inherent to in vivo mouse studies due to high mouse-to-mouse phenotypic variation. In order to maximize the research impact of expensive and labor-intensive mouse studies, it is critical to minimize technical experimental error9,10. Time from animal sacrifice to downstream analysis or tissue fixation introduces experimental variation that may overcome subtle changes and reduce large differences between groups. Therefore, rapid processing of samples is essential for accurate data analysis. The long bone dissection and bone marrow isolation techniques described here are optimized for rapid processing of animals and samples to reduce technical variation.

This protocol can be widely applied to many research fields, including investigation of the bone tissue itself or interrogation of the cells of the bone marrow. In addition, this straightforward approach to long bone dissection will enable researchers in related fields to directly interrogate bone contributions in order to expand our knowledge of bone marrow dysfunction in otherwise understudied pathologies.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NCI grant nos. U54CA143803, CA163124, CA093900, and CA143055 to K.J.P. The authors thank the current and past members of the Weilbaecher lab, especially Katherine Weilbaecher, Michelle Hurchla, and Hongju Deng, and members of the Brady Urological Institute, especially members of the Pienta laboratory for critical reading of the manuscript.

Materials

pinboard
pins
70% ethanol
dissection sissors 
dissection forceps
Kimwipes Kimberly-Clark 34120
16 guage needle
1.5 ml microcentrifuge tube
0.5 ml microcentrifuge tube
microcentrifuge

References

  1. McHayleh, W. M., Ellerman, J., Roodman, G. D. Ch. 80. Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. , 379-381 (2008).
  2. Weilbaecher, K. N., Guise, T. A., McCauley, L. K. Cancer to bone: a fatal attraction. Nat Rev Cancer. 11 (6), 411-425 (2011).
  3. Pedersen, E. A., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. The prostate cancer bone marrow niche: more than just ‘fertile soil. Asian J Androl. 14 (3), 423-427 (2012).
  4. Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
  5. Hurchla, M. A., et al. The epoxyketone-based proteasome inhibitors carfilzomib and orally bioavailable oprozomib have anti-resorptive and bone-anabolic activity in addition to anti-myeloma effects. Leukemia. 27 (2), 430-440 (2013).
  6. Rauch, D. A., et al. The ARF tumor suppressor regulates bone remodeling and osteosarcoma development in mice. PLoS One. 5 (12), e15755 (2010).
  7. Su, X., et al. The ADP receptor P2RY12 regulates osteoclast function and pathologic bone remodeling. J Clin Invest. 122 (10), 3579-3592 (2012).
  8. Dempster, D. W., et al. Standardized nomenclature, symbols, and units for bone histomorphometry: a 2012 update of the report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res. 28 (1), 2-17 (2013).
  9. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483 (7391), 531-533 (2012).
  10. Festing, M. F., Altman, D. G. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 43 (4), 244-258 (2002).

Play Video

Citer Cet Article
Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation. J. Vis. Exp. (110), e53936, doi:10.3791/53936 (2016).

View Video