Summary

en cours d'analyse<em> In Vivo</em> Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Published: April 29, 2016
doi:

Summary

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Abstract

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Introduction

Dans les organismes multicellulaires, la migration cellulaire est essentielle à la fois pour le développement de l'embryon où elle assure l'organisation des cellules dans les tissus et organes, et la vie adulte, où elle participe à l'homéostasie tissulaire (cicatrisation des plaies) et l'immunité. En plus de ces fonctions physiologiques, la migration des cellules est également impliqué dans diverses situations pathologiques, y compris, en particulier, les métastases du cancer.

La migration cellulaire a été analysée in vitro pendant des décennies, fournissant une compréhension globale des mécanismes moléculaires assurant les mouvements cellulaires sur des surfaces planes. In vivo cependant, les cellules sont confrontés à un environnement plus complexe. Il est apparu clairement au cours des dernières années que la migration au sein d'un organisme peut être influencé par des signaux externes tels que la matrice extracellulaire, des cellules ou des chimiokines sécrétées guidage migration voisine, et que les mécanismes d'entraînement la migration cellulaire peut varier de ce qui a été décrit <em> in vitro 1,2. Les mécanismes assurant la migration cellulaire in vivo ont reçu moins d' attention jusqu'à présent, principalement en raison de la difficulté technique accrue, par rapport à des études in vitro. In vivo analyse de la migration cellulaire , en particulier nécessite un accès optique directe aux cellules migrantes, techniques pour marquer les cellules uniques afin de voir leur dynamique et leur morphologie, ainsi que le gain ou la perte de fonction des approches pour tester le rôle des gènes candidats. Jusqu'à présent, seuls quelques systèmes modèles hébergeant ces caractéristiques ont été utilisées pour disséquer vivo la migration cellulaire 3.

Nous avons récemment utilisé la migration de la plaque préchordale prospective dans les embryons de poisson zèbre début comme un nouveau système de modèle pratique pour évaluer la fonction des gènes candidats dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo 4,5 dans. Plaque préchordale prospective (également connu sous mesendoderm antérieur) est un groupe de cellules formant au début de Gastrulation sur la face dorsale de l'embryon. Au cours de la gastrulation ce groupe migre collectivement vers le pôle animal de l'embryon 6-8, pour former la plaque préchordale, un épaississement de mesendodermal, antérieure à la notochorde, et qui sous – tend la plaque neurale. La partie antérieure de la plaque préchordale donnera lieu à l' éclosion de la glande, tandis que sa partie postérieure contribue probablement à la tête mésoderme 9. Merci au développement externe et de la clarté optique de l'embryon de poisson, la migration cellulaire peut être directement et facilement observée dans cette structure.

La transplantation de cellules est une technique très puissante qui permet la création rapide et facile des embryons en mosaïque 10. Exprimer des marqueurs fluorescents cytosquelette dans les résultats des cellules transplantées dans l'étiquetage des cellules isolées, la morphologie et la dynamique qui peuvent être facilement observés. La combinaison de cette perte ou gain de fonction des approches permet l'analyse des fonctions des cellules autonomes d'une boîtegène didat.

Le protocole présenté décrit comment nous avons évalué la fonction de la composante sin1 de TORC2 dans le contrôle de la migration cellulaire et l' actine dynamique in vivo 5. Mais, comme mentionné dans les résultats et discuté plus loin, il pourrait être utilisé pour analyser l'implication potentielle d'un gène candidat pour contrôler la migration des cellules in vivo.

Protocol

Remarque: La figure 1 présente les grandes lignes du protocole. 1. Préparation des aiguilles pour injection et la transplantation Remarque: Les aiguilles peuvent être préparés à tout moment et stocké. Gardez-les dans une boîte de Pétri, sur une bande de pâte à modeler. Sceller le plat avec du parafilm pour protéger de la poussière. Pour aiguilles d'injection, tirez un capillaire en verre (diamètre extérieur 1,0 mm, d…

Representative Results

La technique présentée a été utilisé pour analyser le rôle des sin1, l' une des composantes essentielles de la Tor complexe 2 (TORC2), dans le contrôle de la migration cellulaire in vivo. L'utilisation de la transplantation de cellules permet de marquage des cellules et l'analyse des effets sur les cellules autonomes isolées. Film S1 montre la migration des cellules progénitrices de la plaque préchordale transplantées. étiquetage actine avec ABP1…

Discussion

Ce protocole présente un moyen facile d'étudier le rôle d'un gène candidat dans la migration cellulaire in vivo, en combinant la création d'embryons chimères en utilisant une transplantation de cellules avec l' imagerie en direct.

Création d'embryons mosaïques

Étude de la dynamique d'une cellule nécessite la visualisation de son contour pour analyser les extensions cytoplasmiques. Ceci peut être réalisé par marquage d…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.

Materials

Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) Harvard Apparatus 300085 standard thickness
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) Harvard Apparatus 300085 thin-walled
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml
fine tweezers Dumont Fine Science Tools 11254-20 5F
glass bottom dishes MatTek P35G-0-10-C
Air transjector Eppendorf 5246
Micro-forge Narishige MF-900
Microgrinder Narishige EG-44
Micromanipulator (for injection) Narishige MN-151
Micromanipulator (for cell transplantation) Leica Leica Micromanipulator
Hammilton Syringe Narishige IM-9B
Micropipette puller David Kopf Instruments Model 720
Transplantation mold Adapative Science Tools PT-1
Needle holder Narishige HI-7
Tube connector Narishige CI-1
PTFE tubing Narishige CT-1

References

  1. Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
  2. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  3. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  4. Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
  5. Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
  6. Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
  7. Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
  8. Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
  9. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
  11. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  12. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  13. Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
  14. Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
  15. Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
  16. Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
  17. Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  18. Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
  19. Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  20. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  21. Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
  22. Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).

Play Video

Citer Cet Article
Giger, F. A., Dumortier, J. G., David, N. B. Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (110), e53792, doi:10.3791/53792 (2016).

View Video