Primaire endodermale epitheelcellen Cultuur van de dooierzak membraan van de Japanse kwartel embryo
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
Wij vestigden een endodermale epitheliale celcultuur model (EEG) voor het bestuderen van de functie van bepaalde enzymen en eiwitten in het bemiddelen nutriëntenbenutting door aviaire embryo's tijdens de ontwikkeling. Bevruchte Japanse kwartel eieren werden bij 37 ° C gedurende 5 dagen en dan dooierzak membranen (YSM) werden verzameld om de EEG-cultuur op te zetten. We isoleerden embryonale endoderm laag uit YSM, en gesneden het membraan in 2-3 mm gesneden en gedeeltelijk gedigereerd met collagenase voor het zaaien in 24-well kweekplaten. De EECS vermenigvuldigen uit het weefsel en zijn klaar voor celcultuur studies. We vonden dat de EECS had typische kenmerken van YSM in vivo, bijvoorbeeld, accumulatie van lipide druppeltjes, expressie van sterol O-acyltransferase en lipoproteïne lipase. De gedeeltelijke spijsvertering behandeling aanzienlijk toegenomen de succesvolle tarief van EEG-cultuur. Gebruik makend van de EECS, hebben we aangetoond dat de expressie van SOAT1 werd gereguleerd door de cAMP dependent proteïne kinase A gerelateerde route. Deze primaire Japanse kwartel EEG kweeksysteem is een nuttig instrument om embryonale lipide transport te bestuderen en om de rol van genen die betrokken zijn bij de bemiddeling nutriëntenbenutting in YSM tijdens aviaire embryonale ontwikkeling te verduidelijken.
Introduction
De grotere voedingswaarde bron van het aviaire embryo dooier, bestaande uit 33% lipiden, 17% eiwit en 1% as. 1 tijdens de embryonale ontwikkeling, de dooierzak membraan (YSM) groeit vanuit de embryonale buikholte en geleidelijk omvat de dooier oppervlak. Beginnend bij de embryonale dag 2, wordt genexpressie geassocieerd met de vetstofwisseling en angiogenese geleidelijk verhoogd in YSM, en de YSM ontwikkelt zich langzaam villus-achtige projecties. 8,9 Deze projecties te verhogen absorptie van dooier voedingsstoffen naar de embryonale ontwikkeling te ondersteunen. De YSM is een extra-embryonale weefsel dat drie kiem lagen, endoderm, mesoderm en ectoderm bevat. 14 De dooierzak ectoderm kijkt uit op het eiwit en banden met de vitelline membraan om voorzichtig te dekken de dooierzak. De endodermale epitheelcellen worden direct geconfronteerd met de richting van de eidooier en dienen als nutriëntenbenutting portals. 6 Zoals de YSM uitbreidt, endodermale epitheliale cellen (EECS) kan worden gedeeld door shape en functionaliteit in twee groepen, het gebied vitelline en omgeving vasculosa. 7
Area vitelline bestaat uit endodermale cellen en is ver van het embryo; gebied vasculosa bestaat uit mesodermale cellen en dekt gedifferentieerde EECS met bloedvaten en bindweefsel. Door embryonale dag 5 wordt de dooier volledig onder ectoderm en endoderm van YSM en de vasculaire gebied snel gegroeid. De YSM absorbeert, opnieuw samenstelt en releases lipiden (als-dooier afgeleid zeer low density lipoprotein) en eiwitten in de embryonale bloedsomloop. 9, 2 Daarom is een primaire Japanse kwartel embryonale endodermale epitheelcel kweeksysteem opgericht we, om de mechanismen van lipide bestuderen gebruik in YSM tijdens aviaire embryonale ontwikkeling.
Lipiden zoals triglyceriden, lecithine, fosfolipiden en cholesterol ester (CE) zijn de primaire energiebronnen voor aviaire embryo's. In de vroege stadia van ontwikkeling, dooier lipiden composed van slechts 1,3% CE en het stijgt tot 10-15% op de middellange termijn van aviaire embryonale ontwikkeling 3, is 11. Cholesterol ester gesynthetiseerd uit cholesterol door sterol O-acyltransferase 1 (SOAT1) in aviaire embryo YSM. 4
De opslag vorm van cholesterol is CE, wordt CE uitgevoerd in lipoproteïnen, en lipoproteïnen worden door het verkeer getransporteerd naar weefsels. 13 Een week voor luik is er een snelle groei van aviaire embryo's. Ongeveer 68% van de resterende inhoud lipide in de dooier wordt geabsorbeerd tijdens deze fase. 10 Het mechanisme waarmee lipiden dooier gebruikt kan worden verduidelijkt door EEG onderzoeksmodel. Een kip EEG cultuurprotocol opgericht om dit onderzoek doel te bereiken. 2, 9 Vanwege de lage slagingspercentage weefsel explantaten een verbeterde celcultuur procedure EEG nodig is om de functie van bepaalde enzymen en eiwitten te bestuderen in het mediëren nutriëntenbenutting door aviaire embryo tijdens de ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omdat de vorige cultuur systeem slechts beperkt succes, is een betere kweeksysteem nodig. De Japanse kwartel YSM endoderm vereist een behandeling met proteolytische enzymen zoals collagenase aan de cel-cel verbindingen los te maken om betere groei in de ex-vivo explantaten te bereiken. Onze gegevens tonen aan dat het aantal cellen van gedeeltelijke digestie behandeling na zaaien gedurende 2 dagen (figuur 1) groter is dan de onverteerde weefselkweek waren. Daarom is de gedeeltelijke proteolytische digest…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering voor de ontwikkeling van het huidige protocol is vooral gesteund door "Doel voor de Top Universiteit Plan 'van de National Taiwan University, Taiwan (subsidie ID-104R350144), evenals het ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan (subsidie ID: MOST 104 -2313-B-002-039-my3). We hebben vooral dank de Center for Biotechnology van de National Taiwan University voor het verstrekken van een dier kamer en laboratoriumruimte voor de huidige studie.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents–a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- . . alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
