Summary

الثقافات توليد الخلايا الليفية الأولية من ماوس الأذن والذيل الأنسجة

Published: January 10, 2016
doi:

Summary

نحن تصف الإجراء التجريبي بسيطة وسريعة لتوليد الخلايا الليفية الأولية من الأذنين وذيول الفئران. لا يتطلب إجراء تدريب خاص الحيوان، ويمكن استخدامها لتوليد الثقافات الليفية من آذان المخزنة في RT لمدة تصل إلى 10 يوما.

Abstract

وتستمد الخلايا الأولية مباشرة من أنسجة ويعتقد أن يكون أكثر تمثيلا للالحالة الفسيولوجية للخلايا في الجسم الحي من خطوط الخلايا المحددة. ومع ذلك، ثقافات الخلية الأولية عادة ما يكون لها عمر محدود وتحتاج إلى كثير من الأحيان إعادة تأسيس. الليفية هي مصدر يمكن الوصول إليها بسهولة من الخلايا الأولية. هنا، نحن نناقش إجراء التجارب بسيطة وسريعة لإنشاء الثقافات الليفية الأولية من آذان وذيول الفئران. يمكن استخدامها على بروتوكول إنشاء الثقافات الليفية الأولية من آذان المخزنة في RT لمدة تصل إلى 10 يوما. عند اتباع البروتوكول بعناية، من غير المرجح أن تحدث على الرغم من استخدام الأنسجة غير معقمة تخزينها لفترة طويلة في بعض الحالات التلوث. الليفية تتكاثر بسرعة في الثقافة ويمكن توسيعها لتشمل أعداد كبيرة قبل ان يخضع الشيخوخة تنسخي.

Introduction

وتستمد الخلايا الأولية من الأنسجة ومثقف يعيشون في ظل ظروف في المختبر. ويفترض عموما أن الخلايا الأولية أكثر شبها الدولة الفسيولوجية والخلفية الوراثية من الأنسجة التي نشأت من خطوط الخلايا خلد أو ورم 1. لهذا السبب، الخلايا الأولية تمثل نموذجا مفيدا لدراسة المسائل البيولوجية 2،3. ولكن، على عكس خطوط الخلايا المنشأة التي تنمو إلى أجل غير مسمى، الخلايا الأولية تخضع في نهاية المطاف الشيخوخة في الثقافة وتحتاج إلى كثير من الأحيان إعادة تأسيس.

وتشمل الخلايا الأولية التي تستخدم عادة الخلايا الليفية، الخلايا الظهارية، وخلايا بطانة الأوعية الدموية، والخلايا T والخلايا B، الضامة المشتقة من نخاع العظام (BMDM) والعظام المستمدة من نخاع الخلايا الجذعية (BMDC). وغالبا ما تستخدم الخلايا الليفية كما الخلية الأولية نموذج ثقافة. أنها توفر مزايا رئيسية على الخلايا الأولية الأخرى. وأنشأت مزارع الخلايا بسهولة، حافظ بسهولة ولا تحتاج إلى purificaنشوئها من الخلايا السابقة للثقافة. لديهم الانتشار الأولي السريع وأي شرط لبروتوكولات متوسطة أو تفعيل المتخصصة. الليفية يمكن transfected بكفاءة باستخدام البيولوجية والكيميائية والفيزيائية بروتوكولات 4،5. هناك إمكانية لتخزين الأذنين لمدة تصل إلى 10 يوما في RT قبل إنشاء مزارع الخلايا. الثقافات الليفية تؤدي إلى تصور عمليات حشوية ومناسبة لإعادة برمجة إلى الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا 6.

الليفية هي خلايا هامة من النسيج الضام التي تفرز بروتينات الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية 7. أنها توفر الإطار الهيكلي في العديد من الأنسجة 8 وتلعب دورا أساسيا في التئام الجروح وإصلاح الأنسجة 9،10.

هنا، نحن تصف (4 ساعات <) بروتوكول بسيطة وسريعة لإنشاء الثقافات الليفية من آذان وذيول الفئران 11. البروتوكول يتطلب الحد الأدنى من الماوستجربة لحصاد الأنسجة (وعلى النقيض من البروتوكولات الأخرى 12،13)، ويمكن استخدامها لإنشاء الثقافات من آذان المخزنة في المتوسط ​​في RT لمدة تصل إلى 10 يوما.

Protocol

وتم إيواء الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية حتى euthanization (الرعاية المؤسسية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) المبادئ التوجيهية في جامعة سنغافورة الوطنية واللجنة الوطنية الاستشارية لمختبر أبحاث الحيوان (NACLAR) المبادئ التوجيهية). <p class="jove_title" s…

Representative Results

استخراج الخلايا الليفية من نتائج الأنسجة في كمية كبيرة من الحطام الأنسجة (الشكل 1). وعلى النقيض من الحطام الأنسجة، والخلايا الليفية تلتزم الأنسجة السطوح البلاستيكية الثقافة بين يوم 1 و 3 من الثقافة. وسيلة الثقافات الليفية يمكن تغيير بسلام في يوم 3 من الثقافة، …

Discussion

هنا نقدم إجراء التجارب بسيطة وغير مكلفة وسريعة لإنشاء الثقافات الليفية الأولية من آذان وذيول الفئران. استخراج ينبغي أن يؤدي إلى تقسيم الخلايا الليفية ملتصقة وبسرعة في غضون 3 أيام بعد العزلة من الأنسجة. قيود هاما من الخلايا الأولية هو الشيخوخة، وتوقف نمو دائم 15.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Materials

RPMI-1640 HyClone SH30027.01
Fetal Calf Serum HyClone SV30160.03
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Asparagine Sigma-Aldrich A4159
Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
Ethanol Merck Millipore 107017 Absolute for analysis
Collagenase D Roche Diagnostics 11088866001 From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease Merck Millipore 53702 From Streptomyces griseus 
Tris buffer (pH 8) 1st BASE 1415 Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8) 1st BASE BUF-1053 Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) 1st BASE BUF-2040-10X4L Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X Sigma-Aldrich 59418C-100ML 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2492-20ml 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors Aesculap
Forcep Aesculap AE-BD312R
0.2 μM syringe filter Sartorius Stedim 16534
70 μM cell strainer SPL 93070
Syringe plunger Terumo SS+10L
Cryovial tube NUNC 368362
1.7 ml microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 cm cell culture dish Greiner 664160 Cell culture treated dish 
15 ml conical bottom tube Greiner 188271
50 ml conical bottom tube Greiner 227261
Water bath GFL 1002
Centrifuge Eppendorf 5810R
Incubation shaker Sartorius Stedim Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope Carl Zeiss AG

References

  1. Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
  2. Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
  3. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  4. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  5. Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
  6. Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
  7. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
  8. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  9. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
  10. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
  11. Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
  12. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
  13. Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
  14. Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
  15. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  16. Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
  17. Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
  18. Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).

Play Video

Citer Cet Article
Khan, M., Gasser, S. Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues. J. Vis. Exp. (107), e53565, doi:10.3791/53565 (2016).

View Video