Ex Vivo Cultuur van Chick Cerebellaire Slices en Ruimtelijk Gerichte Elektroporatie van Korrel cel precursoren

Het cerebellum zit aan het voorste uiteinde van de achterhersenen en is verantwoordelijk voor de integratie van sensorische en motorische verwerking in de volwassen hersenen en regulering hogere cognitieve processen ^1. In zoogdieren en vogels, bezit een uitgebreid morfologie en zwaar gelaagde, een resultaat van uitgebreid doorvoer amplificatie van progenitors in ontwikkeling die produceert dan de helft van de neuronen in de volwassen hersenen. Het cerebellum is een onderwerp van onderzoek geweest neurobiologists eeuwenlang en in de moleculaire tijdperk is ook veel aandacht gekregen. Dit heeft niet alleen zijn inherent interessant biologie, maar ook op het feit dat het zwaar is betrokken bij humane ziekten waaronder ontwikkelingsstoornissen genetische aandoeningen zoals autismespectrumstoornissen ² en het meest opvallend de cerebellaire kanker, medulloblastoom ^3, dat is de meest voorkomende pediatrische brain tumor. Belangrijk is een uitstekend modelsysteem binnen which allocatie lot en neurogenese studeren tijdens de ontwikkeling van de hersenen ^4. De laatste jaren is ook vastgesteld als modelsysteem voor de vergelijkende studie van hersenontwikkeling, vanwege de enorme diversiteit van cerebellaire vormen gezien in de vertebraat fylogenie ^5-10.

Het cerebellum ontwikkelt de dorsale helft van rhombomere 1 in de achterhersenen en ontwikkelingsgebied ¹¹ omvat twee primaire progenitorpopulaties de ruitvormige lip en de ventriculaire zone. De ruitvormige lip strekt zich uit rond het dorsale gebied van de neuroepithelium van de achterhersenen aan de grens met de dakplaat. Het is de geboorteplaats van de glutamaat prikkelende neuronen van het cerebellum ^12-14. De ventriculaire zone leidt tot de remmende GABAergic cerebellaire neuronen, het meest opvallend grote Purkinje neuronen ^14,15. Later in de ontwikkeling (van ongeveer embryonale dag 13,5 in de muis; e6 in kuiken ^16), glutamaat Progensatoren migreren tangentieel van de ruitvormige lip en vormen een pial laag van voorlopers: een secundaire voorlopercellen zone genaamd de externe korrel laag (EGL). Het is deze laag die de uitgebreide amplificatie doorvoer die leidt naar de grote aantallen granule neuronen in de volwassen hersenen ondergaat.

Proliferatie in de EGL is lang verbonden met de sub-pial plaats als gevolg van tangentiële migratie van de ruitvormige lip ^17, de schakelaar celcyclus verlaten en neuronale differentiatie van voorlopercellen behoort bij het ​​verlaten van de buitenste EGL laag in het midden EGL ^18. Uitgebreide tangentiële migratie van post-mitotische granule cellen in mediale-laterale as optreedt in het midden en binnenste EGL ¹⁹ vóór definitieve radiale migratie naar de binnenste laag van de korrel rijpe cerebellaire cortex. Migratie van cellen uit de ruitvormige lip over de cerebellaire oppervlakte is afhankelijk van CXCL12 signalering van de pia ^20-22 </sup> En granule cellen drukken de CXCL12 receptor CXCR4. Hun tangentiële migratie is dus denken aan die van de neocorticale tangentiaal migreren remmende interneuron bevolking ^23-25. Intrigerend elektronenmicroscopische studies ¹⁷ hebben gesuggereerd dat EGL cellen met een proliferatieve morfologie behouden pial contact, het koppelen van de cel gedrag proliferatieve mogelijkheden op een manier die doet denken aan de basale voorouders van de zoogdieren cortex ^26. Dit komt tot uiting in de genoemde stratificatie van de EGL in drie sub-lagen die worden gedefinieerd door verschillende extracellulaire milieu en indien granule precursors hebben verschillende genexpressie handtekeningen ^18.

Proliferatie van voorlopers in de oEGL optreedt met een normale verdeling van kloon afmetingen zodanig dat als voorlopers individueel genetisch gemerkt eind embryonale ontwikkeling bij de muis, geven aanleiding tot een mediaan gemiddelde van 250-500 g postmitotischeranule neuronen ^27,28. Proliferatie is afhankelijk van mitogene SHH signalering van onderliggende Purkinje neuronen ^29-32. Het vermogen om te reageren op SHH aangetoond volledig afhankelijk cell autonome expressie van de transcriptiefactor Atoh1 te zijn, zowel in vitro ³³ en in vivo ^34,35. Evenzo heeft celcyclus verlaten en differentiatie getoond afhankelijk van de expressie van het stroomafwaartse transcriptiefactor NeuroD1 ^36, die waarschijnlijk een directe repressor van Atoh1 ³⁷ zijn.

Ondanks deze vooruitgang, en de aanzienlijke vooruitgang in het ontcijferen van de celbiologische basis van de celcyclus exit ^38-42, het fundamentele moleculaire mechanisme (s) dat de beslissing ten grondslag liggen aan de celcyclus verlaten en om de overgang van een voorloper van een differentiërende neuron, en de geassocieerde postmitotische tangentiële migratie in het binnenste EGL en de latere switchradiale migratie, blijft onvolledig begrepen. Dit is grotendeels vanwege het experimentele eigenzinnigheid van de EGL: het laat ontwikkelen, en moeilijk genetisch doel omdat veel van dezelfde neurogene moleculen ook cruciaal vroeger in het leven van korrel precursors in het ruitvormige lip. Om dit probleem te overwinnen zijn talrijke auteurs in vivo en ex vivo elektroporatie ontwikkeld als een methode om de postnatale cerebellum bij knaagdieren ^43-48 richten. Hier hebben we pionier het gebruik van ex vivo elektroporatie in chick op de EGL, die aanzienlijke voordelen vertegenwoordigt in termen van kosten en het gemak bestuderen. Onze methode van elektroporatie en ex vivo stukje cultuur van chick cerebellaire weefsel maakt gebruik van weefsel ontleed uit embryonale dag 14 kuikens op het hoogtepunt van EGL proliferatie. Deze methode maakt genetische targeting van het EGL onafhankelijk van de ruitvormige lip en het stadium voor genetische dissectie van de overgang van granulevoorlopercellen te postmitotische korrel neuron in het cerebellum.