Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

Il cervelletto si trova all'estremità anteriore del romboencefalo ed è responsabile per l'integrazione di elaborazione sensoriale e motore nel cervello maturo e regolazione dei processi cognitivi ^elevati 1. Nei mammiferi e uccelli, possiede una morfologia complessa ed è fortemente lamellare, un prodotto di ampio amplificazione transito dei progenitori durante lo sviluppo che produce oltre la metà dei neuroni nel cervello adulto. Il cervelletto è stato oggetto di studio per neurobiologi da secoli e in epoca molecolare ha anche ricevuto notevole attenzione. Ciò si riferisce non solo alla sua intrinsecamente interessante biologia, ma anche per il fatto che essa è fortemente implicata nella malattia umana, compresa malattie genetiche dello sviluppo come disturbi dello spettro autistico ^{2 e} più visibile il tumore cerebellare, il medulloblastoma ^3, che è il cervello pediatrico più diffuso tumore. È importante sottolineare che si tratta di un ottimo sistema modello entro which per studiare l'allocazione destino e neurogenesi durante lo sviluppo cerebrale ^4. Negli ultimi anni, è stato anche affermato come sistema modello per lo studio comparato di sviluppo del cervello, a causa della grande diversità di forme cerebellari visto attraverso la filogenesi dei vertebrati ^5-10.

Il cervelletto si sviluppa dalla metà dorsale del rhombomere 1 in romboencefalo ¹¹ ed evolutivamente comprende due popolazioni progenitrici primari, il labbro rombico e zona ventricolare. Il labbro romboidale si estende intorno alla regione dorsale del neuroepitelio del romboencefalo al confine con la lamiera del tetto. E 'il luogo di nascita dei neuroni eccitatori glutamatergici del cervelletto ^12-14. La zona ventricolare suscita le inibitorie GABAergiche neuroni del cervelletto, il più prominente dei grandi neuroni Purkinje ^14,15. Più tardi, in fase di sviluppo (da circa 13,5 giorno embrionali nel topo; e6 in pulcino ^16), glutamatergico Progenmodifiche ai contenuti migrano tangenzialmente dal labbro romboidale e formano uno strato pial di progenitori: una zona progenitore secondaria chiamato lo strato esterno dei granuli (EGL). È questo livello che subisce l'ampia amplificazione di transito che conduce l'enorme numero di neuroni granulari presenti nel cervello maturo.

Proliferazione nel EGL è stata a lungo legata alla posizione sub-pial che deriva dalla migrazione tangenziale dalla rombico labbro ^17, con l'interruttore di uscita del ciclo cellulare e la differenziazione neuronale di progenitori essendo associato con la loro uscita dallo strato esterno EGL in mezzo EGL ^18. Extensive migrazione tangenziale di cellule granulari post-mitotici in asse mediale-laterale si verifica nel mezzo ed interno EGL ^19, prima finale migrazione radiale nello strato granuli interno della corteccia cerebellare maturo. La migrazione delle cellule dal labbro rombico sulla superficie cerebellare dipende segnalazione CXCL12 dalla pia ^20-22 </sup> E cellule granulari esprimono il recettore CXCR4 CXCL12. La loro migrazione tangenziale è quindi ricorda quello di tangenzialmente neocorticale popolazioni migranti interneuroni inibitori ^23-25. Curiosamente, elettroni studi microscopici ¹⁷ hanno suggerito che le cellule EGL con una morfologia proliferativa mantenere il contatto piale, che collega il comportamento delle cellule con capacità proliferativa in un modo che ricorda i progenitori basali della corteccia dei mammiferi ^26. Ciò si riflette nel summenzionato stratificazione della EGL in tre sottolivelli che sono definiti da distinti ambienti extracellulari e dove precursori dei granuli hanno genica distinto firme ^18.

Proliferazione di progenitori nel oEGL avviene con una normale distribuzione delle dimensioni clone tale che quando progenitori sono singolarmente geneticamente etichettati al termine dello sviluppo embrionale nel topo, danno luogo ad una media di 250-500 mediana postmitotici gneuroni ranule ^27,28. Proliferazione dipende segnalazione SHH mitogenic dal sottostante Purkinje neuroni ^29-32. La capacità di rispondere a SHH ha dimostrato di essere interamente dipendente cella autonoma espressione del fattore di trascrizione Atoh1, sia de vitro che in vivo ^{33 34,35.} Allo stesso modo, l'uscita del ciclo cellulare e la differenziazione ha dimostrato di essere dipendente dalla espressione del fattore di trascrizione a valle NeuroD1 ^36, che è probabilmente un repressore diretta di Atoh1 ^37.

Nonostante questi progressi, e un notevole avanzamento nel decifrare la cellula base biologica di uscita ciclo cellulare ^38-42, i meccanismi molecolari fondamentali (s) che sono alla base della decisione di uscire dal ciclo cellulare e la transizione da un progenitore di un neurone di differenziazione, e la associato postmitotici migrazione tangenziale nel EGL interno così come l'interruttore dopoalla migrazione radiale, rimanere completamente sconosciuto. Questo è in gran parte a causa della intrattabilità sperimentale della EGL: si sta sviluppando tardi, e difficili da indirizzare geneticamente poiché molte delle stesse molecole neurogenici sono anche fondamentale precedenza nella vita dei precursori dei granuli al labbro romboidale. Per superare questo problema, numerosi autori hanno sviluppato in vivo e ex vivo elettroporazione come metodo per indirizzare il cervelletto postnatale nei roditori ^43-48. Qui, la strada nell'uso di ex vivo elettroporazione in pulcino per studiare la EGL, che rappresenta notevoli vantaggi in termini di costi e convenienza. Il nostro metodo di elettroporazione e ex vivo della cultura fetta di tessuto cerebellare pulcino utilizza tessuto sezionato dal giorno embrionale 14 pulcini al culmine di EGL proliferazione. Questo metodo permette di targeting genetico della EGL indipendentemente dal labbro romboidale e porranno le basi per la dissezione genetica della transizione da granuliprogenitore di postmitotici neurone granello nel cervelletto.