Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso
Summary
We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.
Abstract
Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.
Introduction
L'ingresso del virus influenzale A (IAV) è un processo in più fasi che inizia con il legame del virus ai recettori presenti sulla membrana plasmatica delle cellule bersaglio 1. Il recettore per IAV è l'acido sialico che è presente su una grande varietà di glicoproteine e glicolipidi. La emoagglutinina (HA) proteina di IAV che è presente nella busta virale si lega all'acido sialico e media così fissaggio delle particelle virali alla membrana plasmatica di cellule bersaglio 2. Il virus entra nelle cellule tramite endocitosi clatrina-mediata, ma anche percorsi di inserimento alternativi, come macropinocitosi, sono stati descritti 3-6. L'interazione tra HA e acido sialico sembra essere sufficiente per mediare sia, attaccamento e innescando internalizzazione delle particelle virali 7. Tuttavia, i recettori di ingresso alternativi sono stati proposti e il loro ruolo nella voce IAV sono attualmente in fase di studio 1,8,9.
Curtualmente, gli sforzi sono fatti per identificare i fattori dell'ospite che sono coinvolti nel ciclo di vita virale con l'obiettivo di sviluppare nuove terapie urgenti antivirali 10-12. Virus ingresso sarebbe un passo favorevole per il targeting crescita IAV al fine di bloccare l'infezione virale nel suo punto più presto. Misurare diverse fasi di ingresso IAV sperimentalmente è impegnativo come di solito grandi quantità di virus sono necessari per individuare il virus in arrivo. Inoltre, il campo di rilevamento delle variazioni entrata del virus è lineare solo a causa della mancanza di replicazione virale. Ciò sottolinea la necessità di test ad alta sensibilità.
Il saggio qui presentiamo permette il rilevamento di virus attaccato alla superficie cellulare e rilevamento del virus internalizzato in relazione alla quantità totale di virus associato alle cellule. L'utilizzo di virus di tipo selvatico biotinilato permette conveniente misurazione attraverso colorazione con STV-Cy3 e la lettura mediante citometria a flusso. Virus Biotinilato è freddo legato alla cellas per consentire l'attaccamento, ma impediscono l'internalizzazione delle particelle virali. Le cellule possono essere fissate, permeabilizzate e colorate con STV-Cy3 per misurare il virus allegato. Il segnale da virioni extracellulari, allegati può essere abrogata se un passo bloccante viene applicata prima fissazione in cui le cellule vengono incubate con streptavidina-etichettato (STV). In una fase successiva, a seguito dell'adesione di biotinilato IAV, la temperatura è spostato a 37 ° C e l'interiorizzazione di particelle virali è permesso di prendere posto. Particelle interiorizzato sono protetti da legame di STV consentendo in tal modo la discriminazione tra i virus extra- ed intracellulari.
Per condizione sperimentale, sono necessari quattro campioni: '0 min': Il primo esempio, l'etichetta '0 min', è quello di misurare il virus legato a freddo sulla superficie cellulare. '0 min + STV': Il secondo campione, etichettato '0 min + STV', dà l'intensità del segnale di base di questo esperimento. Il virus si è bloccato with STV e il seguente segnale di colorazione con STV-Cy3 dovrebbero essere molto inferiore rispetto al campione '0 min'. '30 Min ': Il terzo campione, '30 minuti' contiene attaccato e internalizzata virus a causa del passaggio di temperatura a 37 ° C per 30 min. '30 Min + STV ': Il quarto campione, la data del 30 min + STV' misura la frazione intracellulare di virus. Il passo di blocco STV viene applicato dopo il periodo di incubazione 30 min. Come risultato, le particelle virali sulla superficie cellulare sono vincolati da STV lasciando solo virus internalizzati disponibile per colorazione con STV-Cy3. La quantità relativa di virus internalizzati può essere calcolato come rapporto del virus internalizzati (misurata nel '30 min + ATS 'esempio) divisa per la quantità totale di virus (descritta dal '30 min' esempio).
Come controllo si consiglia di includere cellule mock-infettate. Il segnale seguente STV-Cy3 colorazione delle cellule mock-infettate dà lo sfondorisultante dal protocollo di colorazione. Un controllo per il fissaggio IAV è il pre-trattamento delle cellule con neuraminidasi batterica (NA). Unirà NA off acido sialico da glicoproteine cellulari, eliminando in tal modo i recettori di attacco dalla superficie cellulare. Sodio azide (SA) è un inibitore del metabolismo potenti e quindi blocchi endocitosi 13. Cellule trattate con sodio azide dovrebbero essere positivi per il legame virus, ma negativo per l'internalizzazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro protocollo descrive un modo semplice per misurare l'attaccamento virus e internalizzazione mediante citometria a flusso. Esso consente l'utilizzo di virus di tipo selvatico marcato che imita più da vicino le infezioni da virus rispetto all'uso di particelle simili a virus (VLP). Mentre il nostro protocollo è stato ottimizzato per misurare attaccamento e internalizzazione di IAV può essere facilmente adattato per altri virus. Inoltre, come la citometria a flusso è utilizzato per la lettura, co-c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del Fondo nazionale svizzero (31003A_135278) per SST. MOP è il beneficiario di una borsa di dottorato di ricerca del Fondo AXA. Ringraziamo Patricia Nigg aiuto per la progettazione di figura 1.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
References
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virolog. 2, (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G., Macey, M. G. . Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
