JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Генерация и количественный анализ импульсных низкочастотных Ультразвуковое на Определить Соник Чувствительность необработанных и обработанных опухолевых клеток

Published: July 22, 2015
doi:
10.3791/53060
, , , ,
1Department of Biology,Syracuse University

Summary

Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.

Abstract

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.

Introduction

Ультразвук относится к любому колебательной волны звукового давления с частотой, превышающей верхний предел слуховых способностей человека (~ 20 кГц) 1. Низкий ультразвуковой частоты в диапазоне от 20-60 кГц была использована в лаборатории в качестве средства генерации эмульсий, подготовка клеточные образцы для выделения нуклеиновых кислот, за разрушение ткани, и для различных других тестов. Утилита низкой частоты ультразвука также был продлен до промышленных условиях для сварки, очистки различных материалов, а также в обработке материалов. Коммерчески доступные ультразвуковые генераторы бывают частот от 18-60 кГц, а полномасштабная мощностей, от 100-1,200 W.

Несмотря на то, ультразвуковое уже давно используется в клинических условиях для диагностической визуализации, как она была нанесена в качестве лечебного воздействия лишь недавно. Ультразвук ≥1 МГц способен безопасно нарушающих мочевые камни (камни в почках) и желчных камней (камни в гое желчного пузыря или в печени) у пациентов, чтобы уменьшить симптомы 2,3. Этот подход известен как экстракорпоральное ударная волна литотрипсии (ДЛТ) в настоящее время широко применяется в клинике (более одного миллиона пациентов ежегодно лечатся с ДЛТ в Соединенных Штатах 4), и предлагает модальность, по которым неинвазивного разбить камней с минимальным побочным ущербом посредством использования извне, сосредоточены, высокой интенсивности акустических импульсов 2-4.

Из-за уникальных прямых поперечных сил, а также кавитационных пузырьков, генерируемых высокой интенсивности ультразвука, эти методики были рассмотрены в раковой терапии для лечения резистентного к кастрации рака предстательной железы и рака поджелудочной аденокарциномы в подход, известный как высокой интенсивности сфокусированного ультразвука (HIFU ) 5-8. В порядке, очень похожей на ДЛТ, HIFU использует множество лучей ультразвука и фокусирует их на выбранном тематической области, чтобы генерировать температуру 60 ° C или HIGей за счет использования акустической энергии, вызывая коагуляционный некроз в ткани-мишени 5. Хотя другие методы термической абляции в настоящее время существуют (радиочастотная абляция, микроволновая печь абляция), HIFU предлагает явные преимущества над этими методами в том, что это только неинвазивным гипертермическая модальность 5. HIFU достиг смешанные результаты в клинике и в настоящее время доступна только в клинических испытаниях 8-11. Тем не менее, ограниченный успех он добился, и очень перспективным в данных, полученных из естественных условиях доклинических моделях млекопитающих продемонстрировали потенциал ультразвука в терапии рака.

В целях улучшения HIFU, исследователи попытались объединить УЗИ с соответствующими противоопухолевых агентов для создания формы sonochemotherapy. Sonodynamic терапия (СДТ) является перспективным новым методом лечения, который продемонстрировал впечатляющий противоопухолевой активностью в как в пробирке и <em> В естественных условиях исследования 1. Было показано, что ультразвук преимущественно повреждает злокачественные клетки, основанные на разности между размером таких клеток и тем нормальной гистологии 1,5. ОДР включает специализированные средства, известные в sonosensitizers увеличить степень повреждения льготного оказываемого ультразвука против опухолевых клеток. В то время как терапевтические применения ОДР ранее рассмотрены, ультразвуковые системы, используемые, как правило, используют более высокий частотный ультразвук (≥1 МГц), а также последствия низкого кГц ультразвука частотой до сих пор не полностью изучены. Более низкие частоты ультразвука, часто более опытными в производстве инерционный кавитации, явление, которое приводит к разрушению клеток из-за быстрого рушится микропузырьков, вызывая физико повреждения 12-14. Эта разница в образовании инерциальной кавитации между МГц и низкой ультразвука кГц был приписан к тому, что более низкие частоты волн позволит микропузырьковS больше времени вырасти за счет диффузии выпрямленного в расширительный полупериода, следовательно, производить более жестокие разрушается во время следующей половине цикла сжатия 12.

Ранее мы показали, что U937 моноцитов клетки лейкемии человека чувствительны к низкой частоте ультразвука (23,5 кГц), и что эта чувствительность может быть значительно увеличена за счет применения противоопухолевых агентов, которые возмущают цитоскелета 15. Кроме того, мы показали, что клетки преимущественно поврежденных в зависимости от размера, с более крупных клеток, проявляющих более высокую чувствительность ультразвуковой. Кроме того, нормальные человеческие гемопоэтические стволовые клетки (hHSCs) и лейкоциты при сопоставимых размерах клеток гораздо более устойчивы к обработке ультразвуком, чем их аналоги опухолевых 15, предварительно предположить, что низкая частота ультразвука могут быть использованы, чтобы повредить преимущественно злокачественных клеток в присутствии нормальных тканей.

Для дальнейшего изучения уникальный реквизитчению свойств ультразвука низкой частоты для потенциального терапевтического применения, мы разработали очистки и стабилизации процедуры, чтобы повысить эффективность и надежность одного из наших действующих систем обработки ультразвуком Branson Model АЛОС 150 Вт, 40 кГц сотовый дезинтегратора, оснащен 20 мм рога установлены в 7,62 см чашки. Кроме того, мы смогли определить его точные энергии образец кавитации, а также последовательные сигналов и амплитуду в диапазоне от 40 кГц с использованием кавитации метр и осциллограф с гидрофона. По переработке и систематизации наших протоколов, мы смогли установить последовательность в наших экспериментальных sonications, что позволяет нам количественно сравнивать звуковые чувствительность опухолевых и нормальных клеток различных линий гистогенетических. Наш протокол для системы 40 кГц представлены в обширной подробно для того, чтобы заинтересованных лабораторий, чтобы быть способным выполнять сопоставимые эксперименты и оценки наши выводы противоопухолевых эффектов, вызываемыхнизкая частота ультразвука. Кроме того, мы рассмотрим в зависимости от дозы воздействия метил-β-циклодекстрина (MeβCD, рисунок 1), холестерина разрушающих агента, по повышению ультразвуковой чувствительность U937 и Thp1 моноцитных лейкозных клеток человека.

Protocol

1. Очистка сотовый Sonifier системы Очистите союз между рог и преобразователя с помощью хлороформа и мазок из хлопка. Нанесите легкую нефть или минеральное масло на резьбу рога и преобразователя для дальнейшего удаления накопление металлической стружки, ржавчины или окисления. Используйте хлороформ для удаления масла и любые другие загрязнители из союза после вытирая темы с маслом. 2. Сборка Cell Sonifier и настройка системы Снова рог на преобразователь. Чтобы правильно моментом систему, удалите собранную конвертер и рог с чашки сборки, потянув рог из нижней части чашки (рис 2А). Поместите гнезда ключ в одном из трех небольших отверстий в верхней части преобразователя (фиг.2В). Затем, поместите крутящий момент-ключ, оснащенный пешком дюймовый воронье ½ на выдолбленной части рога (рис 2B). Затянуть в сtandard по часовой стрелке до тех пор, метр крутящего момента не читает 54,23 N. м (рис 2С), крутящий момент, рекомендованный производителем 16. Установите затянувшийся конвертер и рога обратно в чашку, и смонтировать рог и конвертер для кольцевого стенда в вертикальном положении. Снова преобразователь для питания перед установкой системы для экспериментального дозирования импульса. Установите систему дозирования импульса с использованием 1 сек ультразвуком с 1 сек между импульсами. Различные модели дозирования могут быть использованы для других экспериментальных условиях. Многие переменные, такие как объем воды и диаметр рога потенциально потребует изменений в этой дозировки. Используя вышеупомянутые типы образцов клеток, объем и концентрацию, эмпирические данные и наблюдения привели к формулировке этого режима дозирования. Адаптировать систему к желаемой амплитуды. В этом протоколе, использовать 33% и 50% амплитуды, чтобы предотвратить полное уничтожение клеток, которые будут оказывать эффективность sonosensitратилось трудно или невозможно измерить. ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании сравниваются амплитуды. 3. Оценка системы интенсивность и функции Держите кавитации метр на 1,5 см, что уровень образца ультразвуком. Обратите внимание на показания оценить, что система работает на ожидаемой интенсивности. Использование текущих уровнях системы и воды, ожидать между 100-110 Вт / см 2 для 33% амплитуды и 115-125 Вт / см 2 для 50% амплитуды. Обратите внимание на показания кавитации метра от экрана метра, которая представляет кавитации энергию в Вт / см 2 непосредственно. Возьмем эти показания на поверхности воды, и обеспечить отсутствии пузырьков присутствуют на поверхности зонда м. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что эти процедуры проводятся без крышки для доступа над рога. Они не должны быть повторены после каждого ультразвуком. Скорее всего, они должны быть выполнены только после уборки, сборке и настройке системы. </LI> Поместите гидрофона в пробирку, содержащую образец 12,5 мл воды, чтобы полностью погрузить датчик гидрофона. Приостановить гидрофон, используя кольцо стенд. Приложить гидрофона к входу осциллографа, чтобы оценить характеристики формы сигнала. Проверьте осциллограф для четкой синусоидальной волны, как аномальным волны могут изменять частоту системы из спецификаций производителя. Оба метр кавитации и осциллограф дать показания частоты, но только осциллограф покажет аномальные волны, которые свидетельствуют о неисправности системы или неправильного монтажа. 4. Подготовка клетки и среду Подготовьте среду с помощью 240 мл Исков модифицированной среде Dubecco (IMDM) и 50 мл фетальной бычьей сыворотки. Не таять фетальной бычьей сыворотки в ванну с горячей водой, а быстрый рост температуры может привести к компромиссу в сыворотке стабильности. Смешайте 240 мкл гентамицин 50 мг / мл и 5 мл пенициллина/ Стрептомицина 100x в стандартной культуральной колбы, и добавить к среде. Хранить среду при температуре 4 ° С. Семенной клетки U937 в ~ 4 х 10 4 клеток / мл в 25 см2 колбу, используя подготовленную среду. Оценить клеток для концентрации и жизнеспособности клеток с использованием счетчика TC20 и трипанового синего путем размещения 15-20 мкл клеток и 15-20 мкл трипанового синего в микро-центрифужную пробирку и перемешивания содержимого. Pipette15-20 мкл этой смеси в TC20 выборки слайде, и инициировать рассчитывает путем размещения слайд в клеточной счетчика TC20. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2, и проверить их жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего и клеток счетчик TC20. Когда клетки в соответствующей концентрации и / или были обработаны с sonosensitizers для соответствующего времени, трансфер 3 мл клеток из культуральной колбе до 20 мл стеклянный сцинтилляционный флакон. В этом протоколе, растут клетки U937 в течение 48 ч, а затем обрабатывают 0,5, 1,или 5 мМ MeβCD в течение 30 мин, чтобы в достаточной степени истощают холестерина в клетках перед обработкой ультразвуком. 5. Сотовый Озвучивание Дега деионизированной дистиллированной воды и с использованием вакуума и Бюхнера колбу. Передача воды в чашеобразной рога, и заполнить до уровня 15 мм над верхней части рожка. Процесс обработки ультразвуком приводит к дальнейшему дегазации воды в течение нескольких минут, и может привести к несогласованности в течение эксперимента, если система не работает до образца ультразвуком. Таким образом, запустить систему ~ 7 мин до образца ультразвуком. Прикрепите сцинтилляционный флакон, содержащий клетки удерживающего устройства. Затем прикрепите стопорное устройство в верхней части чашки рога и установить на высоте 15 мм от верхней части рога (на поверхности воды с использованием скользящего механизма). Клетки обрабатывали ультразвуком, как правило, с использованием трех 1 сек импульсы ультразвука, с 1 сек интервал между каждым из этих импульсов. Для этогоПротокол, соникатные клетки в 33% и 50% амплитуды с использованием дозирования вышеуказанные импульса. 6. Оценка ячейки для Нанесенный пост-обработки ультразвуком Оценка взвешенных клеток для повреждения и жизнеспособности с использованием трипанового синего и клеток счетчик TC20. Кроме того, анализ образца с помощью счетчика Z2. Для Z2 счетчика анализа, пипетки суспензии клеток 100 мкл в 20 мл изотонического солевого раствора (200: 1) отношение. Перед анализом промойте апертуры анализатора частиц Z2, по крайней мере в два раза, используя изотонический солевой раствор. Поместите образец Z2 в держатель счетчика, и поднять платформу для апертуры до начала подсчета. Приобретать данные счетчиков TC20 и Z2, используя программное обеспечение, предоставленное производителем. Анализ этих данных для повреждения клеток, жизнеспособности и создания сотовой мусора из ультразвуком. 7. ХТТ, чтобы определить Жизнеспособность и митохондриальной активности обработанных U937 и Thp1 клеток ПриоR в ХТТ анализе, растут и U937 Thp1 клеток в тех же условиях. Предварительной обработки клеток с той же концентрации в диапазоне от MeβCD в течение 30 мин до обработки ультразвуком. Как и прежде Используйте те же параметры ультразвуковых исключением того, что клетки в настоящее время обрабатывают ультразвуком с использованием выбор 1-3 сек один импульсов расстоянии одного сек на части, чтобы разработать ряд ущерба для набора ХТТ оценки. Примечание: Многие из этих шагов взяты непосредственно из комплекта инструкции XTT и повторяются только для удобства заинтересованных лабораторий. Собирают клетки центрифугированием при 200g в течение 10 мин. Ресуспендируют осадок клеток в ростовой среде описано ранее. Ресуспендируют клетки в ~ 1 х 10 5 клеток / мл. Семенной клетки U937 в количестве 100 мкл на лунку в плоскодонных 96-луночного планшета для микротитрования в трех экземплярах, а затем повторить для Thp1 клеток с использованием отдельной 96-луночного планшета. Включите 3 контрольные лунки, содержащие 100 мкл полной среды роста только в пустых значений оптической плотности. Затем, инкубировать засеянные пластины для 24 ч. Размораживание два аликвот реагента ХТТ и активирующего реагента при 37 ° С до использования. Вихревые аликвоты осторожно до тех пор, прозрачные растворы не будут получены. Добавить 0,1 мл реактива активации до 5,0 мл реагента ХТТ, который образует достаточно активированного раствора ХТТ в течение одного 96-луночного микротитровальных планшетов анализа. Повторите процесс для другой пластине. Добавьте 50 мкл активированного ХТТ раствора в каждую лунку. Вернуться пластину к культуре клеток СО 2 инкубатора в течение 2 ч. Встряхнуть тарелку аккуратно после инкубационного периода, чтобы равномерно распределить оранжевый цвет в положительных скважин. Измеряют поглощение аналитические лунки, содержащие клетки и контрольных лунок фон управления на длине волны 450-500 нм между длиной волны, используя счетчике микротитрационных плашек. Либо ноль читателя планшетах с помощью пустых скважин управления или вычесть их среднее значение из конкретных результатов. Измеряют поглощение всех аналитические лунки снова при wavelengго между 630-690 нм и вычитать значения из значений 450-500 нм, полученных. Примечание: Это второе определение поглощения помогает устранить неспецифические показания результатов анализов. ХТТ повторили четыре раза для обеих клеточных линий.

Representative Results

Стабильность системы имеет первостепенное значение в получении повторяемых и надежных результатов. Соответствующую спецификацию крутящий момент 54,23 Н м. Достигается правильное соединение преобразователя и сонотрода 2, с последовательностью сигнала оценивается посредством использования осциллографа и гидрофона (фиг.3А). 3В изображает измерения внутри флакона образца, и 3С оценивает стабильности в чашки рога. Как и следовало ожидать, амплитуда была несколько снижена из-за некоторой энергии, поглощаемой стеклом. Тем не менее, форма волны не возмущенные или искажены в любом панели В и С, что необходимо для надежной доставки звуковой энергии к образцу. Сигнала, который не появляется в виде прозрачного особой синусоиды показывает неисправный датчик или ненадлежащее установки. Это выражается в рисунке, который показывает 3D несколько аномальным волны, отсутствие четкой синусоидальной волны, и частоты чтения нетт ожидать с надлежащим образом функционирующей системы. Метр кавитации используется для измерения энергии, вырабатываемой кавитации (рисунок 4) обнаружили, интенсивность звука будет 100-110 Вт / см 2 при амплитуде 33%, и 125-130 Вт / см 2 при 50% амплитуды. После того, как система 40 кГц был надлежащим образом откалиброван и собраны в полном объеме (рис 5), надежное уничтожение клеток легко достигается, как определено обоих счетчиков TC20 и Z2 (рисунок 6). Как и ожидалось, более обширные повреждения клеток наблюдалось в популяции клеток ультразвуком при 50%, а не на 33% амплитуды. Тем не менее, 33% амплитуды полезно в качестве отправной точки для обнаружения потенциальных эффектов звукового сенсибилизации вводимых агентов, как это производит заметное повреждение, но оставляет пространство для более повреждение быть обнаружен, когда агенты применяются для оценки их потенцирование ультразвуковой чувствительности. Это показано на рисунке 7А, гдев зависимости от дозы эффекты MeβCD на потенцирования ультразвуковой чувствительность клеток U937 представлены. Хотя, не обработанных ультразвуком MeβCD обработанные клетки были очень похожи на жизнеспособность, не являющихся ультразвуком, необработанных клетках, жизнеспособность заметно снизился после трех импульсов ультразвука 1 сек 40 кГц была применена. Кроме того, снижение жизнеспособности после обработки ультразвуком видимому, был дозозависимым, а 5 мМ MeβCD производится наибольшее снижение количества клеток, а затем 1 мм, а затем 0,5 мМ MeβCD. Аналогичное воздействие на жизнеспособность клеток и митохондриальной активности наблюдалось в обоих U937 и Thp1 клеток, обработанных различными концентрациями MeβCD до обработки ультразвуком, как определено с помощью набора ХТТ (фиг.7В). Хотя Thp1 клетки-видимому, немного более устойчивы, чем звуковое клеток U937, обе линии лейкемии человека повреждены в зависимости от дозы. Более высокие концентрации MeβCD и больше импульсов ультразвука Продuced низкий снижение XTT к растворимой, яркие оранжевый производной для обоих U937 и Thp1 клеток, соответствующих снизить жизнеспособность клеток и активности митохондрий. Рисунок 1. Молекулярная структура метил β-циклодекстрина. (А) Полная структура метил-β-циклодекстрина (MeβCD). (Б) MeβCD представляет собой полимер из семи повторяющихся звеньев с R группы обе Н или СН 3. Молекулярная формула: C 56 H 98 O 35. Молекулярный вес = 1331,36. Рисунок 2. Надлежащим torqueing ультразвуковой системы 40 кГц. (А) и преобразователь звуковой сигнал удаляют из чашки PRIили torqueing. (Б) Расположите ключ гнезда и динамометрический ключ на своих позициях. (С) Применить 54,23 Н. М крутящего момента в направлении по часовой стрелке, прежде чем снова прикрепить рог и преобразователь в чашку. Рисунок 3. Использование осциллографа, чтобы охарактеризовать сигнала ультразвуковой системы. (А) осциллограф с гидрофона может быть использована для оценки амплитуды и формы сигнала консистенцию. Запись (В) приняты с чашкой непосредственно над рога на 1,5 см и устанавливается на 33% амплитуды. (С) сигнал изображен здесь с чтением приобретенного при гидрофон помещается в 20 мл стекл нный сцинтилл ционный флакон. Флакон расположен на 1,5 см выше рога и снова установить при амплитуде 33%. (D), осциллограф Скриншот оСистема FA с аномальным частотах можно было бы ожидать с неисправной системы или ненадлежащее сцепления рог преобразователя союза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4. Использование кавитации метр охарактеризовать интенсивность звука ультразвукового системы. Кавитация метр увидеть здесь используется для представления кавитации энергию в Вт / см 2. Это очень важный инструмент для оценки согласованности энергии по отношению к образцу. Рисунок 5. Основные компоненты системы ультразвуковой частотой 40 кГц. Ультразвуковая система показана в комплекте с чашки рога ( <stroнг>), нагревательное устройство (В), преобразователь (С), и механизм позиционирования образца (D). Такая конструкция позволяет легко позиционировать образца (E) выше рог (F). Рисунок 6. Влияние различных уровней амплитуды на ультразвуковой лизис клеток U937 с использованием счетчиков TC20 и Z2. Клетки обрабатывали ультразвуком с частотой 40 кГц dismembrator клеток на 33% амплитуды (100-110 Вт / см 2) или 50% амплитуды (125-130 Вт / см 2) с использованием трех 1 сек импульсы ультразвука, с интервалом 1 сек между каждым этих импульсов. (А) экрана от счетчика программного обеспечения Z2 демонстрирует эффект обработки ультразвуком на клетках U937. (B) Данные из счетчика TC20 были составлены в виде графика, чтобы продемонстрировать воспроизводимость результатовс. Эти данные включают в себя общие и живые количество клеток, а также трипанового синего оценивается жизнеспособность клеток. Бары отражают стандартную ошибку среднего (SEM) для 4-х независимых клеточных популяций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Фигура 7. Воздействие метил β-циклодекстрина на потенцирования ультразвуковой чувствительность U937 и Thp1 клеток. (A) U937 клетки обрабатывали с различной концентрацией MeβCD в течение 30 мин до того, как обрабатывали ультразвуком при помощи ультразвука 40 кГц (105 Вт / см 2 ) с использованием трех 1 импульсов сек на расстоянии 1 сек друг от друга. Клеточных популяций были сгруппированы в ≥12 ≥17 мкм и мкм. (B) или U937 Thp1 клетки снова обрабатывали с различной ОБОГАЩЕНИЯрационы MeβCD в течение 30 мин до того, как обрабатывали ультразвуком с системой 40 кГц с использованием 1-3 импульсов в 1 сек ультразвука разнесены друг от друга в 1 сек. Жизнеспособность клеток и митохондрий деятельность были оценены с комплектом XTT. 100 мкл клеток высевали на лунку в плоскодонных микротитрационного планшета 96-луночного. Планшет инкубировали в течение 24 ч перед добавлением раствора ХТТ. Затем клетки инкубировали в течение дополнительных 2 ч, прежде чем длина волны был прочитан. Бары отражают SEM для 4-х независимых клеточных популяций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Для достижения оптимальных результатов, особое внимание должно быть принято тщательно позиционировать образец и очистить Конвертер рога союз. Размещение образца в рога важно для получения последовательной разрушение клеток, а изменяя расстояние от рожка будет изменять акустическую очаги, и, следовательно, изменяет энергию образец подвергают воздействию. Акустическая энергия в чашки рога могут быть отображены с помощью кавитации метр, чтобы найти положение максимального кавитации. Кроме того, измеритель кавитации, а также с помощью осциллографа жизненно важны для определения интенсивности звука клетки подвергаются воздействию, а также однородности сигнала. Таким образом, эти инструменты должны быть использованы для обнаружения проблем с системой, и помочь определить, какие поиска неисправностей могут быть необходимы для коррекции нестабильности системы.

Как упоминалось ранее, система низкой частоты может выступать в дальнейших дегазации воды в течение всего эксперимента, если не работал в течениенесколько минут до образца ультразвуком. Этот первоначальный выполнения должны быть выполнены для получения относительно дегазированной обработки ультразвуком среду и, таким образом, последовательные результаты во время экспериментов. Кроме того, клетки не должны быть ультразвуком на или вблизи максимальной амплитуды при оценке эффективности sonosensitizers, а истинный объем сенсибилизации будет трудно оценить. Использование амплитуду 33% на системы 40 кГц является идеальным местом, как это производит заметный ущерб, но и обеспечивает sonosensitizers широкие возможности для демонстрации их эффективности, как показано с MeβCD против U937 и Thp1 клеток (рисунок 7). Эти данные также подтверждают, что MeβCD сенсибилизирует несколько линий лейкозных к низкой частоте ультразвука в зависимости от дозы.

Там были ряд экспериментов, сделанных с высокой частотой в диапазоне от 0,75 МГц до 8 МГц, показывая свидетельства внутримембранных кавитационных пузырьков генерируется через ультразвуком 17-19. Тем не менее, Questioнс все еще ​​остаются в отношении точного механизма ультразвукового индуцированных лизиса клеток 18. Мы показали связь между псевдоожижающей цитоскелета и повышенной чувствительности звуковой использованием низкой частоте ультразвука 15, явление, продемонстрированные других лабораторий 20, 21. Кроме того, мы обнаружили, что микрофиламентов, разрушающие агенты, такие как цитохалазином потенцировать ультразвуковой чувствительность в нескольких лейкозов линии, но не hHSCs или лейкоциты 22, предполагая, что ингибирование полимеризации актина может быть механизмом sonosensitizing особый интерес. Мы также отметили, что винкристин, микротрубочек, разрушающие агент, который ингибирует полимеризацию тубулина 23, 24, заметно повышает чувствительность ультразвукового различных типов лейкозов в пробирке в том числе острой миелоидной лейкемии, хронической миелоидной лейкемии, и острого лимфолейкоза. В отличие от этого, цитоскелета-направленный агенты, стабилизирующие компоненты цитоскелета (паклитакселд jasplakinolide) появляются, чтобы сделать клетки устойчивы к ультразвуком, отражается низких темпов клеточного лизиса 22. Взятые вместе, эти данные подтверждают гипотезу, что псевдоожижения цитоскелета компоненты опухолевых клеток действительно важным фактором повышения эффективности ОДР 25. Данное исследование также показывает, что истощение холестерина может быть другой способ, с помощью которого в дальнейшем усиливать ультразвуковую чувствительность опухолевых клеток, а MeβCD обработанные клетки U937 заметно чувствительным к ультразвука 40 кГц.

В то время как наши протоколы обработки ультразвуком продемонстрировали заметное противоопухолевой активностью в пробирке, нынешняя методология ограничивается работать в культуре и малых позвоночных моделей, которые способны вписаться в пузырьках, используемых для обработки ультразвуком. Мы показали, что данио могут быть безопасно обрабатывают ультразвуком с помощью импульсного низкочастотного ультразвука (20 кГц), и что их толерантность к химиотерапевтическим агентам количественно сравнимы сДозы переносятся мышиных моделях 26, предполагая, что несущих опухоль данио могут быть использованы в предварительных исследований с целью оценки в естественных условиях противоопухолевой активностью этих протоколов. Тем не менее, введение химиотерапевтических агентов перед ультразвуком модели млекопитающих было сообщено в диапазоне МГц 1, и такие протоколы вероятно, может быть расширен, чтобы включить низкую частоте ультразвука, а также холестерина слой, и цитоскелета-направлены агентов.

Потенциальные клинического применения этой формы SDT может включать экстракорпоральной крови ультразвуком, в котором противоопухолевые агенты вводят внутривенно (IV) до крови должны быть устранены для обработки ультразвуком 25. Этот метод удаляет потенциальные звуковые препятствия, связанные с человеческой анатомии, и может быть эффективным способом повредить лейкозных взрывов, а также метастазов солидных опухолей. Также возможно, что холестерин слой, и направленного цитоскелета агенты моглииспользоваться в HIFU протоколов, которые уже рассмотрены в клинике в попытке улучшить эффективность этого метода лечения.

Методы, описанные в настоящем исследовании, способна оценить значение возможных sonosensitizers и дальнейшее совершенствование системы может повысить эту утилиту. Тем не менее, есть много переменных, которые необходимо учитывать при использовании таких устройств, используемых ультразвуковых, в том числе качества электроэнергии питания, акустических фокусов, и индивидуальной изменчивости среди преобразователей. Таким образом, будущие исследования будут сосредоточены на визуализации звуковых волн и понимание их влияния на результаты. СДТ показал для повышения лизис клеток в пробирке и может оказаться клинически жизнеспособным, если более в естественных данных в моделях млекопитающих приобрела. Эксперименты изучения других потенциально годные для использования характеристики злокачественных клеток, а также различные комбинированные формы с участием нескольких агентов и ультразвука продолжать в нашей лаборатории.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes  Life Technologies 12440079
Amphotericin B Solution  Sigma-Aldrich A2942 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution  Life Technologies 10378-016
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn Branson Ultrasonics 101-063-726 sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater Brisk Heat SDCJF1A-GBH1000-1 heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software Beckman-Coulter 6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Gentamicin 50mg/mL Sigma-Aldrich G1397 
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
Falcon 50mL & 25mL Vented Culture Flasks Fisher Scientific 353082
Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl Lonza 17-605C 
Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps Beckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet  BrandTech Scientific 26330
USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets USA Scientific 1071-0810
Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips USA Scientific 1120-1840, 1126-7810
100uL Micropipette  Wheaton 851164
1000uL Micropipette Wheaton 851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides Bio-Rad 145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator Forma Scientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO2002B used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter PPB Megasonics PB-500  used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone Teledyne TC4013-1  connects to the oscilloscope 
Wheaton 250mL Flasks Sigma-Aldrich Z364827
20mL Glass Scintillation Vials  Sigma-Aldrich Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution  Beckman-Coulter N/A diluent for Z2 counter
Chloroform 99% Sigma-Aldrich C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous  Sigma-Aldrich 459836
Mineral Oil N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit ATCC 30-1011K
96-Well Microplate Reader Cole-Palmer  EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC TIB-202
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trendowski, M. The promise of sonodynamic therapy. Cancer Metastasis Rev. 33 (1), 143-160 (2014).
  2. Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis. J Urol. 179 (1), 194-197 (2008).
  3. Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial. J Urol. 174 (2), 595-599 (2005).
  4. McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review. Rev Urol. 15 (2), 49-60 (2013).
  5. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 4 (3), 255-260 (2005).
  6. Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer. BJU Int. 110 (9), 1228-1242 (2012).
  7. Li, P. Z., et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11 (6), 655-660 (2012).
  8. Xiaoping, L., Leizhen, Z. Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer. Int J Hyperthermia. 29 (7), 678-682 (2013).
  9. Lukka, H., et al. High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review. Clin Oncol (R Coll Radiol). 23 (2), 117-127 (2011).
  10. So, A. I. HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer). Can Urol Assoc J. 5 (6), 424-426 (2011).
  11. Crouzet, S., et al. Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients. Eur Urol. 65 (5), 907-914 (2014).
  12. Tezel, A., Mitragotri, S. Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).
  13. Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport. Pharm Res. 19 (8), 1160-1169 (2002).
  14. Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 32 (5), 916-920 (2009).
  15. Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells. Anticancer Res. 34 (5), 2195-2202 (2014).
  16. Lagneaux, L., et al. Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells. Exp Hematol. 30 (11), 1293-1301 (2002).
  17. Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (8), 3258-3263 (2011).
  18. Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J. 84 (5), 3087-3101 (2003).
  19. Mizrahi, N., et al. Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics. Soft Matter. 8 (8), 2438-2443 (2012).
  20. Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization. J R Soc Interface. 11 (95), 20140071 (2014).
  21. Trendowski, M., et al. Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound. Cancer Lett. In press, (2015).
  22. Dumontet, C., Sikic, B. I. Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death. J Clin Oncol. 17 (3), 1061-1070 (1999).
  23. Verrills, N. M., Kavallaris, M. Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies. Curr Pharm Des. 11 (13), 1719-1733 (2005).
  24. Trendowski, M. The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy. Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).
  25. Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo. In Vivo. 28 (6), 1021-1031 (2014).

Tags

Low Frequency UltrasoundNeoplastic CellsCell LysisSonodynamic TherapySonicationSonosensitizersCytoskeletonCholesterol DepletionPreclinical Assessment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Trendowski, M., Christen, T. D., Zoino, J. N., Acquafondata, C., Fondy, T. P. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (101), e53060, doi:10.3791/53060 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image