使用急性海马脑片啮齿动物突触标记/捕获和交叉捕获的研究

所有动物的程序批准了新加坡国立大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。 1.准备与人工脑脊液（学联） 制备ACSF由（以mM计）124 NaCl的，3.7氯化钾，1.0 硫酸镁 ·7H 2 O，2.5氯化钙 2·2H 2 O，1.2 KH 2 PO 4，24.6碳酸氢钠 ，和10 D-葡萄糖。确保ACSF的pH为7.2-7.4之间时鼓泡在电生理记录到饱和用95％ 的 O 2和5％CO 2的混合物（卡波金）。21使用该人工脑脊液两个解剖，切片准备和用于灌注。 注：使用干净的设备，用于测量和保持学​​联。使用不洁的设备可能会导致混浊的解决方案或形成沉淀。使用去离子水的各项准备工作。 准备一个2升10X学联股票不包括碳酸氢钠 </s的ub>和D-葡萄糖在容量瓶中。加入试剂以去离子水按照以下顺序：氯化钠（144.96克），氯化钾（5.52克）， 硫酸镁 ·7H 2 O（4.92克）， 氯化钙 2·2H 2 O（7.56克），KH 2 PO 4（3.28用磁力搅拌器以确保所有试剂溶解连续至少30分钟克）和顶部高达2 L.体积搅拌。存储股票在4℃，2周内使用。 在此之前的解剖和实验中，稀释ACSF库存在容量瓶随着加入所需量的NaHCO 3和D-葡萄糖。对于1升溶液，加入2.07克碳酸氢钠和1.802克D-葡萄糖稀释后，将100毫升的股票，以1升。学联应无任何沉淀或溶解的颗粒的澄清溶液。 凉爽约200-300毫升的ACSF上的冰，以解剖过程中可以使用。确保用于解剖的学联介于2-4℃。使用的electrop剩余学联hysiological实验。泡所有的ACSF溶液饱和与卡波金（5％CO 2，95％O 2）的连续。在等待学联冷却，准备清扫面积和片室。 2.编制界面商会注意：一个接口脑切片室，用于培养该切片并在电生理记录保持它们（ 图2B），包括两个隔室。下部腔室包含蒸馏保持在32℃的水通过一个温度控制器和带卡波金连续鼓泡。 切换温度控制器上，并在32℃预设。通过流入管道运行蒸馏水洗10到15分钟，上腔室。确保上部室是放置在网前的清洁。检查在底部室中水位约70％填充有蒸馏水。 放置网中的上腔室，以提供一搁置表面为切片（ 图2C）。调整流出管道，以确保该溶液水平被充分润湿网的整个区域。放置净上述盖子上腔室内保持加湿卡波金气氛。 调节流速为1毫升/分钟。保持整个切片潜伏期和实验这个流速。启动carbogenating新配制的1X学联沉浸流入管进入学联。允许20分钟的ACSF要与卡波金以及上腔室被填充有它的饱和。 3.准备急性海马脑片注：解剖协议包括（1）除去大脑从动物到冷ACSF和（2）分离和海马的切片。为了让神经细胞保持活力，隔离和快速地将大脑在寒冷学联和完成整个过程包括在3-5分钟切片。 切除脑入冷的ACSF 铺陈清扫工具，可在图 1A中所示的方式。根据使用的为了便于解剖过程安排的工具。在开始之前，确保所有的清扫工具都准备好了。 安装一个刀片，用乙酸乙酯萃取，无水乙醇和蒸馏水清洗，放置到手动组织斩波器（ 图1B），牢固地固定，并确保该切削刃被均匀地排列。试验斩波一张滤纸，以确保刀片牢固地固定。设置的滑动游标微米至其起始位置。 安乐死在利用动物的二氧化碳（CO 2）在感应腔和斩首用绷带剪刀 ​​或断头台。使用虹膜剪，去掉皮和毛皮的头骨上面。做一个切口穿过后删除brainstem.Make沿个一个小切口Ë右侧颅骨和左侧较长的切口。 注意！使只有一个小的切口，以被用于实验，以避免损坏它的一侧。当插入剪刀，确保施加的力向上，以避免损坏到大脑。 小心地用一个骨咬骨钳从左边开始向右侧颅骨以显示皮质除去头骨。薄层硬膜也可见到。小心取出正面板的咬骨钳。除去大部分硬脑膜连同正面板上。 注意！要小心，硬脑膜不经过大脑组织切片。 如果任何除去残留的硬膜，特别是在用抹刀的平坦端皮质和小脑之间的交界处。对于步骤3.1.5和3.1.6，有保有压，即向上，远离大脑，避免损坏。用锅铲轻轻舀大脑进入一个培养皿中充满了寒冷和carbogenated学联（2-4℃），PLA土木工程署铝制散热块上。 海马隔离用手术刀，使直切以除去小脑和另一个切以除去脑（约四分之一）的前部。使沿中线浅伤口。 小心地用镰刀洁牙机去除皮质，从中线开始显露背海马。除去皮质海马以上的层。用手指或镊子角度来支持大脑。做一个小切口，以海马连合。轻轻地用镰刀定标器使用滚动运动背海马开始取出海马。 注意！要轻柔，避免拉伸和撕裂海马。 卸下所有皮质和周围的隔离海马结缔组织与镰刀定标器。 切片海马组织和转移切片到接口室将一块ACSF-的浸泡滤纸（1级，30mm）的在手动切片机切片阶段。舀并将海马组织到过滤纸上。移动滤纸对齐海马在相对 ​​于限幅器的叶片的适当的取向，使得海马切片在约70度到伞的角度。 吸干，围绕着一个折叠滤纸的海马组织（85 mm粒级1）离开海马微湿多余的解决方案。启动横向切片海马。切片和丢弃的组织从海马的末端，其中所述片的形态是不明确的。 切片剩余组织成400微米厚的片。从与用温和刷卡动作软刷毛的刷子刮板拾取海马切片轻轻并将切片入一个小烧杯装满冷carbogenated ACSF。执行的步骤3.3.1-3.3.3尽快由于海马组织暴露于空气中。注：通常三分之二的海马切片，和4-6片，用清晰的形态可制得。 转移片轻轻地放在网上堰板腔中使用干净的塑料巴斯德吸管具有宽尖端（通过切除2-3厘米的尖端的制造）。仔细调整片上用小注射器弯曲尖端的净位置。定位片以有利于电极的位置和记录的方式。检查，以确保片由ACSF充分包围但不被水淹没或浮动（图2C-D）。盖上室和孵化切片2-3小时。 注：在健康切片的锥体细胞层应该表现出一些透明度。 4.录音的CA3-CA1突触反应注：电设置用于场势记录示于图2A。一法拉天笼强烈建议，如果电磁干扰超出电设置正确的接地后控制。是市售的许多不同类型的淹没和接口腔室。然而，接口室优选作为他们切片表现出更强大的突触反应。 电极定位打开电气设备中使用（刺激剂和放大器）。安装并固定刺激和记录电极的显微的有机玻璃持有人。 注：我们使用单极，5MΩ电阻漆涂层，不锈钢焊条为刺激和录音的目的。 使用前，将拉玻璃毛细管内这些电极与环氧胶暴露的电极头（ 图2E）的一小部分固定。这给力的，否则细长电极，并帮助确保它们的稳固的ELEctrode持有人。 在显微镜下的指导下，在海马CA1区域的辐射层放置刺激电极（多个）刺激谢弗侧支纤维和记录电极在CA1区的顶端树突区域来记录场EPSP（fEPSP）的反应。 注：接近液体表面与电极片上面给出了一个声音，有助于快速定位片（提供，放大器被连接到一个扬声器）的表面上。 在突触标记和捕获实验，根据实验的需要，在记录电极的任一侧的位置两个或三个刺激电极（S1，S2或S3）刺激两个或多个独立的，但重叠的输入。放置约200微米相距刺激和记录电极。 如果有必要，找到地层中的锥体层的另一个记录电极来记录人口峰值（ 图3A）。当这两个电极已经触及切片，用采集软件，对测试的刺激，以确保正确fEPSP信号。 注意：我们使用双相，恒流脉冲（脉冲持续时间的0.1毫秒/半波），用于测试刺激​​。 一旦获得适当的fEP​​SP信号，小心地约200μm深使用操纵器的微动旋钮的电极。允许20分钟的片恢复。测试通路的独立性与配对的脉冲便利化的协议27,28。 输入输出关系通过测量在一定范围的电流​​强度的斜率值确定每个输入的输入 – 输出关系（传入刺激VS fEPSP斜率）。 20μA之间执行此为100μA。然后将刺激强度对于每个输入以获得最大的fEPSP斜率的40％。保持整个实验此常数。 后15-20分钟，开始记录基线。监视的FEPSP斜率密切在此期间和重置刺激强度如果斜率波动从设定值的10％以上，并开始一个新的基线。在继续之前得到至少30分钟或1小时稳定的基线。 注：对于测试或基线的刺激，我们用四次扫描的0.2赫兹双相，恒定电流脉冲（每个极性0.1毫秒）给予每5分钟。这四种反应的平均斜率则认为是一个重复。的信号进行滤波和放大的差分放大器，数字化使用模拟 – 数字转换器，并与定制软件在线监测。 使用刺激方案的LTP / LTD诱导注：两个LTP和LTD被归类为早期和晚期-LTP / LTD基于蛋白质合成的要求;后者需要翻译和/或转录为它的后期维修[综述见4]。各种电刺激范式可以specificallŸ诱导不同形式的LTP和有限公司。 WTET：100赫兹，21双相恒定电流脉冲（每相0.2毫秒）。 STET：三连发的100个脉冲一秒（100赫兹），每10分钟（每脉冲相位宽度0.2毫秒）。 900脉冲串在15分钟的持续时间。 1一阵由3个脉冲（0.2毫秒宽度）为50毫秒（20赫兹）的脉冲间隔。间脉冲串间隔是1秒（2700脉冲的总数）。 5.清洗切片商会和灌注系统在记录结束后，收集海马做进一步生化分析，否则丢弃适当。关闭卡波电源和温度控制器。洗蒸馏水卡波起泡。 用刷子和蒸馏水彻底清洗净。用蒸馏水在一个较高的流速洗钻机15-20分钟。一旦在3-4天，更改蒸馏水腔室的下部隔室和也干净腔室经常用3％过氧化氢溶液，以避免真菌生长。