Vi har utvecklat en ögonirritationstest som utnyttjar en tredimensionell rekonstruerad human hornhinna liknande epitel (RHCE) vävnadsmodell. Testet kan skilja mellan ögonirriterande och frätande material (GHS kategori 1 och 2 kombinerade) och de som inte kräver märkning (GHS ingen kategori).
För att uppfylla den sjunde ändringen av kosmetikadirektivet och EU: s Reach-lagstiftningen EU behövs validerade utan djurförsök alternativa metoder för säker och korrekt bedömning av okulär toxicitet hos människa. För att tillgodose detta behov har vi utvecklat en ögonirritationstest (EIT) som utnyttjar en tredimensionell rekonstruerad human hornhinna liknande epitel (RHCE) vävnadsmodell som bygger på normala mänskliga celler. EIT kan skilja okulära irriterande och frätande (GHS kategori 1 och 2 kombinerade) och de som inte kräver märkning (GHS ingen kategori). Testet utnyttjar två separata protokoll, en avsedd för flytande kemikalier, och en andra, liknande protokoll för fasta testartiklar. EIT prediktionsmodell använder en enda exponeringsperiod (30 min för vätskor, 6 h för fasta ämnen) och en enda vävnadsviabilitet bryt (60,0% enligt bestämning med MTT-analysen). Baserat på resultaten för 83 kemikalier (44 vätskor och 39 fasta ämnen) EIT uppnådde 95,5 / 68,2 / och 81,8% sensitivity / specificitet och noggrannhet (SS & A) för vätskor, 100,0 / 68,4 / och 84,6% SS & A för fasta och 97,6 / 68,3 / och 83,1% för den totala SS & A. EIT kommer att bidra avsevärt till att klassificera den okulära irritationspotentialen hos ett brett spektrum av flytande och fasta kemikalier utan användning av djur för att uppfylla regulatoriska krav test. Den EpiOcular EIT metoden infördes 2015 i OECD: s testriktlinjer som TG 492.
Konsumentprodukter såsom kosmetika, tvättmedel och rengöringsmedel innehåller en mängd olika kemikalier som kan framkalla allvarliga skador om de kommer i kontakt ögonen. Därför är testning av dessa medel för ögonirritation som krävs av USA: s och EU: s tillsynsmyndigheter att garantera konsumenternas säkerhet 1. En bedömning av ögonirritationspotentialen av blandningar och beredningar är också ett krav för att uppfylla REACH (Registration, Evaluation, Authorization och begränsning av kemikalier) lagstiftning för märkning av kosmetiska ingredienser enligt direktivet om EU: s kosmetika för transport av kemikalier, och för märkning av bekämpningsmedel och hushållsprodukter 2. För närvarande, tillsynsmyndigheter kräver okulär riskbedömning med hjälp av globalt harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) 3. GHS bygger huvudsakligen på Draize ögonirritation, den mest använda ögonirritation analys, i vilken främmande ämnen och mixtures införs direkt in i konjunktivalsäcken i kaninögat 4. Enligt GHS-klassificering, GHS kategori 1 (ämnen som är frätande) avser att testa kemikalier som orsakar svår initial skada på ögat vävnader eller allvarlig skada på ögat och vision som inte är fullt reversibla inom 21 dagar efter exponering 3,5. GHS kategori 2 avser att testa kemikalier som ger betydande förändringar i ögat som är fullt reversibla inom 21 dagar efter exponering. Test kemikalier som inte är frätande eller irriterande kallas GHS ingen kategori.
För mer än 40 år, har Draize test på kaninögon kritiserats för sin brist på reproducerbarhet, överskattning av reaktioner hos människan, och användning av levande djur 5-8. Dessa farhågor har uppmuntrat många förslag till förfining, reduktion, och ersättning av den in vivo-test 9. Behovet av validerade alternativ till djurförsök stärktes ytterligaregenom antagandet av den sjunde ändringen av kosmetikadirektivet, som förbjöd användning av djur i säkerhetsutvärdering av kosmetiska produkter (2005) och ingredienser (2009) 2.
Sedan 1996 har den rekonstruerade hornhinnan liknande vävnadsmodell använts i stor utsträckning av den kosmetiska industrin för att utvärdera irritationspotentialen av råvaror, ytaktiva baserade formuleringar, och förvärras blandningar som är avsedda för användning i eller i närheten av, ögat 10-13. Användning av vävnadsmodell RHCE möjliggör direkt topisk applicering av testmaterialet på vävnadsytan i dess nativa, outspädd form. På detta sätt kan icke-vattenlösliga formuleringar testas utan att späda dem med lösningsmedel. Som svar på EURL ECVAM: s (Europeiska unionens referenslaboratorium Europeiska centret för validering av alternativa metoder) begäran om en allmänt tillämplig, enkel och ekonomisk metod ögonirritation Test (EIT), som utnyttjar en single exponeringstid och kan skilja okulära irriterande och frätande från material som inte kräver märkning utvecklades (Figur 1) 14. Baserat på resultaten för 83 kemikalier (44 vätskor och 39 fasta ämnen), EIT uppnådde 95,5 / 68,2 / och 81,8% känslighet / specificitet och noggrannhet (SS & A) för vätskor, 100,0 / 68,4 / och 84,6% SS & A för fasta och 97,6 / 68,3 / och 83,1% för den totala SS & A.
År 2007, en multi-laboratorium pre-valideringsstudie sponsrad av Cosmetics Europe (tidigare Colipa) under överinseende av referenslaboratorium ECVAM bedömde relevansen och tillförlitligheten i ETI med målet att föra den till formell validering 15. I denna studie var 298 oberoende studier utförs i sju oberoende laboratorier. Studieresultat visade 99,7% avtal förutsägelse med låga variationskoefficienter över alla deltagande laboratorier 15. Som ett resultat under 2010 EIT protokollet trädde en formell EURL ECVAMvalideringsprogram. Valideringsstudien användes 104 kodade prov kemikalier, inklusive enskilda ämnen och kemiska blandningar, som in vivo-referensdata (Draize ögonirritation) fanns tillgängliga. Baserat på framgångarna med detta arbete var en OECD riktlinje utkast prov lämnas in 2014. Det förväntas att EIT kommer att bidra avsevärt till klassificering av okulär irritationspotentialen hos ett brett spektrum av material enligt FN: s GHS-klassificering och märkning.
Vi har presenterat det ögonirritationstest (Figur 1) som utvecklats för vävnadsmodell EpiOcular. EIT kan skilja okulära irriterande och frätande (GHS kategori 1 och 2 kombinerade) från material som inte kräver märkning (GHS ingen kategori) med hög grad av känslighet och specificitet 17. EIT som presenteras här inte diskriminera mellan GHS Kategori 1 från kategori 2 kemikalier. EIT validerades för klassificering och märkning av okulär irritationspotentialen hos ett brett spektrum av kemikalier, inklusive kosmetika och farmaceutiska substanser. I samband med andra in vitro-tester kommer EIT att fungera som en ersättning för in vivo kaninögonirritationstest.
EIT använder två liknande men distinkta protokoll för flytande och fasta material, som varierar i längd av exponering och efter exponering inkubationsperioder (Figur 1). Ändpunkten används i ETIär vävnadsviabilitet, bestämdes genom MTT-analysen, som tidigare har använts i validerade humana epiteliala vävnadsmodeller 20,21. För att utföra denna analys, behövs ingen särskild utrustning förutom standardcellodlingsutrustning. På grund av den höga nivån av vävnad-till-vävnads reproducerbarhet, n = 2 vävnader i stället för den vanligtvis rekommenderade n = 3 används. Möjligheten att använda n = 2 vävnader är en viktig aspekt av protokollet, eftersom den tillåter en erfaren operatör för att behandla två vävnader samtidigt, vilket minimerar variationen i analysen som kan uppstå på grund av olika hantering av enskilda vävnader 14. Också genom att använda n = 2 vävnader per testartikeln, den irritations av 10 testsubstanser i samma aggregationstillstånd (flytande eller fast), tillsammans med de positiva och negativa kontroller, kan utvärderas med hjälp av ett kit (24 vävnader).
Andra viktiga punkter som säkerställer tillförlitlig klassificering av material specifikationer för den positiva kontrollen SUbstance (vävnadsviabilitet ≤50.0%), reproducerbarhet mellan dubbla vävnader (skillnad <20,0%), och negativ kontroll OD-avläsningar (> 0,8 och <2,5).
När du utför EIT testet, är det viktigt att hålla fast vid det validerade protokollet och den föreslagna doseringen och skölj scheman (tabellerna 3 och 4), eftersom avvikelser från protokollet eller förändringar i inkubationsperioderna kan leda till förändrad utfall. På samma sätt kommer avvikelser från 3 timmar tid för MTT inkubation resultera i olika MTT avläsningar och kan påverka analysresultatet.
Ibland kan en testkemikalie har optiska eller andra egenskaper som kan störa MTT vävnadsviabilitet analys eller orsaka reduktion av MTT. Till exempel kan en testkemikalie direkt minska MTT i blålila reaktionsprodukt, eller kan vara en färgad substans som absorberar ljus i samma storleksordning som MTT formazan (~ 570 nm). Men dessa testkemikalier prESENT ett problem endast om vid tidpunkten för MTT analysen, är fortfarande närvarande på (eller absorberas av) vävnaden en tillräcklig mängd av materialet. För att undvika denna störning är omfattande sköljförfaranden införlivas i EIT protokollet. Om sköljning inte bort TA och TA stör MTT minskning, måste ytterligare kontroller användas för att detektera och korrigera för det. I korthet, vid misstanke direkt MTT minskning av testkemikalien vill säga 50 ^ (eller 50 mg för fasta ämnen) av kemikalien i fråga inkuberades under 3 timmar med arbets MTT-lösning på SCC (NC, 50 l sterilt avjoniserat vatten, bör vara körs samtidigt). Om MTT-lösning blir blå-lila, är testföremålet förmodas ha reducerat MTT. I detta fall bör utföras en funktionskontroll med hjälp av fryst dödade vävnads kontroller för att utvärdera om testmaterialet bindning till vävnaden och leder till en falsk MTT minskning signal. Om det finns märkbar MTT-minskning i TA-exponerad, dödade vävnadskontroll(i förhållande till mängden i den obehandlade viabla vävnaden), den genomsnittliga vävnads livskraft testföremålet måste korrigeras genom att subtrahera medelvärdet livskraft de avlivade kontrollen.
EIT felar på sidan av säkerhet, vilket framgår av den låga förekomsten av falska negativa klassificeringar 14,15,18. Viktigt ingen av GHS kategori 1-ämnen, som är frätande på ögat och som representerar den allvarligaste okulär fara, klassificerades som icke-irriterande i denna analys 14,15,18,19. Slutligen är en av de stora fördelarna med RHCE in vitro testmetod möjligheten att testa ren vätska och fasta material (vilket inte är möjligt med två-dimensionell, nedsänkta cellkulturer).
EIT kommer att bidra avsevärt för att bestämma okulär irritationspotentialen hos ett brett spektrum av material enligt FN: s GHS-klassificering och märkning. Utbyte av djur för att bestämma oCular toxicitet har varit ett mål för toxikologisk forskning i många år. EIT testmetoden har slutfört en formell valideringsstudie som stöds av EURL ECVAM 2014 och EpiOcular EIT genomfördes i OECD: s riktlinjer för test som OECD TG 492 år 2015.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr John Harbell för hans vetenskapligt stöd och tid ägnas åt EIT projektet. Författarna vill också tacka Beiersdorf AG (Tyskland), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble / Cosmital (Schweiz), Laboratoire Pierre Fabre (Frankrike), Harlan Laboratories (United Kingdom), och LVMH Parfym (Frankrike) för att delta i multicenter International Pre-och valideringsundersökningar av ögonirritation Test 15.