Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

1. Voorbereiding van het RHCE weefsels voor de behandeling – dag 0 Na ontvangst van de commerciële menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) kit, controleer alle kit onderdelen voor integriteit (voor kit details Standard Assay Kit Components (tabel 1) en apparatuur en materialen die nodig zijn om het EIT assay (tabel 2) uit te voeren. Op de dag van ontvangst, evenwicht weefsels (in zijn 24-en scheepvaart container) aan RT gedurende 15 min. Bedrag Reagens Voorwaarden Bron Beschrijving Houdbaarheidsdatum 1 Verzegelde 24-well plaat van EpiOcular weefsels (OCL-200) 2-8 ° C MatTek Bevat 24 tissUES van celkweek inserts, pakket op agarose 72 hr 1 fles, 200 ml EpiOcular proefmedium (OCL-200-ASY) 2-8 ° C MatTek DMEM medium op basis 21 dagen 1 fles, 100 ml Ca ++ Mg ++ -Gratis Dulbecco's-PBS (DPBS) RT Sigma-Aldrich, D5652 of equiv. Gebruikt voor het spoelen van inserts 1 jaar 4 6-well platen RT Valk Gebruikt voor het behoud van de weefsels tijdens assay-protocol NA 2 12-well platen RT Valk Gebruikt tijdens assay-protocol NA 2 24-well platen RT Valk Gebruikt MTT assay uit te voeren NA 1 flacon, 0,5 ml Methylacetaat (CAS # 79-20-9) RT Sigma-Aldrich, Cat # 186325 Gebruikt als PC in de assay 1 maand Tabel 1: standaard Assay Kit Components. / Materiaal Nodig voor: Bevochtigde incubator (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO2, 90 ± 10% vochtigheid) Incuberen weefsels voorafgaand aan en tijdens assays Laminaire stroming kap Veilig werken onder steriele omstandigheden Vacuümpomp (optioneel) Opzuigen medium en oplossingen Plate reader-fotometer (96 putjes) Reading OD Plaat shaker Extraction van formazan Steriel, stompe randen tang Omgaan met weefsel inserts Stophorloges Termijn voor de toepassing van de test materialen en andere getimede stappen in het protocol Waterbad (37 ± 1 ° C) Warming media en MTT oplossing Mortier en een stamper Slijpen korrelige vaste stoffen Verdringerpomp pipet (50 ui) Toepassing van viskeuze en halfvaste stoffen en suspensies Instelbare pipetten (200 gl-2 ml) Aanbrengen van vloeibare materialen, assaymedium en MTT Pre-gesteriliseerde tips (200 ul en 20 ul), Rainin Cat # HR-200F en HR-20F (of gelijkwaardig) Aanbrengen van vloeibare materialen, assaymedium en MTT Brede opening pre-gesteriliseerde tips (250 pl), Rainin Cat # HR-250WS (of equivalentalent) Toepassing van viskeuze en halfvaste stoffen en suspensies 8 oz / 220 ml specimen containers, Falcon Cat # 3.540.200 (of gelijkwaardig) Spoelen weefsels Steriel eenmalig gebruik spuiten (bijvoorbeeld 1 ml tuberkulin spuit Omnifix-F, B. Braun AG, kat. No. 9161406V) Levering van ~ 50 mg vaste stoffen (optioneel) Ted Pella micro spatel / lepel, Ted Pella Inc, Cat # 13504 (of gelijkwaardig, scherpe lepel of bot curette, bv Aesculap, No: FK 623) Levering van ~ 50 mg vaste materialen Ca ++ en Mg ++ vrij Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (Ca ++ Mg ++ vrije-DPBS): Sigma-Aldrich, Cat # D5652 (of equivalent) Spoelen weefsels tijdens test Steriel gedemineraliseerd water, weefselkweek waardering (kwaliteit biologische of gelijkwaardig) <td> Gebruik als NC 96-well platbodem platen Falcon (of equivalent) Voor het lezen OD Wattenstaafje swaps (steriele) Voor het drogen van het weefseloppervlak (optioneel) Plakband of Parafilm Afdekplaten tijdens formazanproduct extractie MTT-100 testkit Bevat MTT thiazolyl tetrazolium bromide reagens (Sigma # M-5655) en isopropanol extract. Tabel 2: Apparatuur en materialen die nodig zijn om het EIT uit te voeren. Onder steriele omstandigheden, open de plastic zak met de 24-wells plaat met het RHCE weefsels en verwijder het steriele gaasje. Inspecteer alle weefsels voor luchtbellen tussen de agarosegel en plaats. Niet kweken met luchtbellen onder het inzetstuk bedekking> 50% van het inzetstuk gebied defecte weefsels of weefsels while ch zijn volledig bedekt met vloeistof. Label de 6-well platen met het testvoorwerp of controlecodes en blootstellingstijden. Aliquot 1,0 ml Assay Medium (geleverd bij de kit), voorverwarmd tot ca. 37 ° C, in de putjes van gelabelde 6-wells platen. Gebruik steriele pincet om elke insert bevattende RHCE weefsel in het gelabelde 6-wells plaat verwijderen en het inzetstuk. Tijdens deze stap verwijdert alle resterende verzendkosten agarose dat zich aan de buitenzijde van het inzetstuk door zachte blotting op steriel filtreerpapier. Los eventuele luchtbellen gevangen onder de inserts. Pre-incubeer het RHCE weefsels in de 6-well platen standaard kweekomstandigheden (SCC, vochtige atmosfeer met 5 ± 1% CO2 bij 37 ± 1 ° C) gedurende 1 uur. Na 1 uur werd vervangen proefmedium met 1,0 ml vers proefmedium voorverwarmd tot 37 ° C en incubeer de RHCE weefsels bij SCC condities (overnight = O / N) (16-24 uur). . ove_title "> 2 Pre-behandeling – Dag 1 Nadat de O / N incubatie toepassing 20 gl Ca2 + Mg2 + -vrij-Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS, voorzien) met een geschikte inrichting pipetteren. Als de DPBS niet verspreid over de weefsels, tik het inzetstuk op de plaat te verzekeren dat de DPBS plast gehele weefseloppervlak. Incubeer de RHCE weefsels bij SCC 30 ± 2 min. Opmerking: Deze stap is noodzakelijk om weefselhydratie en te bootsen in vivo omstandigheden. 3. testmateriaal Blootstelling Procedures Breng iedere testvoorwerp en controles RHCE weefsels dupliceren (n = 2). Het testvoorwerp doseringsprocedure verschilt vloeistoffen en vaste stoffen. Lokaal toepassen 50 ul van vloeistof testen artikelen met behulp van een pipet. De belichting voor vloeistoffen is 30 min. Breng 50 mg vast testvoorwerpen met een waterpas lepel (gekalibreerd om 50 mg natriumchloride houden). De ex-Posure tijd voor vaste stoffen is 6 uur. Opmerking: Vloeistoffen worden gedefinieerd als vloeibare stoffen (bijvoorbeeld vloeistoffen, gels en crèmes) die kunnen worden aangebracht onder toepassing van een inrichting pipetteren. Vaste stoffen worden gedefinieerd als niet-vloeibare stoffen (bijvoorbeeld poeders, harsachtige of wasachtige materialen) die niet kunnen worden aangebracht met een pipet. Indien de fysische toestand van te testen niet eenvoudig te bepalen, plaatst de vaatjes met testartikel in een waterbad gedurende 15 min (37 ° C). Volg EIT protocol voor vloeistoffen voor degenen testen artikelen die vloeibaar bij 37 ° C. Gebruik een positieve verplaatsing pipet voor bijzonder viskeuze materialen. Dosis de negatieve controle en de positieve controles en daarna de dosis de test artikelen. Breng 50 gl van de negatieve controle (NC) en positieve controle (PC) het RHCE weefsels met een standaard pipet. De NC is steriel gedeïoniseerd water; de PC is methylacetaat (CAS # 79-20-9). Breng de NC en PC voor 30 min bij testening vloeibare testartikelen en gedurende 6 uur bij het testen van solid-test artikelen. 4. Test Artikel Exposure – Dag 1 Voor de behandeling van vloeistof testen artikelen, volg dan de timing schema in tabel 3. Laat 1 minuut intervallen tussen toepassingen van elke test artikel gelijke blootstelling voor alle weefsels te garanderen. Na 30 ± 2 min DPBS voorbehandeling, topisch 50 pl NC en PC, en elke vloeistof testvoorwerp dien lokaal op het RHCE weefsels met behulp van een geschikt apparaat pipetteren. Breng 50 gl van het testartikel vloeistof direct op het weefsel aan het bovenoppervlak bedekken. Afgesneden van de smalle punt van de pipet tip om de opening voor viskeuze materialen te verbreden. Voor zeer viskeuze materialen toepassen testartikel een doseerinrichting (een vlak geleide cilinder met een diameter enigszins kleiner dan de binnendiameter van het weefsel insert of a plastic punaise), keren de dosering device en plaats het op het weefsel, zodat de test artikel gelijkmatig contact van het weefsel oppervlak. Als testartikel niet verspreid over het weefsel, tik de insert om ervoor te zorgen dat het zich verspreidt over het hele weefsel oppervlak. Mechanische spreiding van de testartikelen (bijvoorbeeld met een pipet tip) wordt niet aanbevolen aangezien dit de weefsels beschadigen. Incubeer de weefsels bij SCC 30 ± 2 min. Voor de behandeling van vaste testvoorwerpen – Dag 1, volgt de timing schema in tabel 4 Een 2 min intervallen tussen applicaties elk testvoorwerp gelijke belichting voor alle weefsels verzekeren.. Na 30 ± 2 min DPBS voorbehandeling toepassen 50 pl NC en PC topisch op het RHCE weefsels met behulp van een geschikt apparaat pipetteren. Voor vaste testvoorwerp toepassing, verwijder de inzetstukken (n = 2) vanaf de put en plaats ze op een steriel oppervlak (bijvoorbeeld het deksel van amultiwell plaat) om een ​​test artikel morsen in het medium te voorkomen. Met behulp van een lepel genivelleerd, topisch ongeveer 50 mg van het testartikel op het weefseloppervlak toegepast; ervoor zorgen dat het oppervlak van het weefsel volledig bedekt het testvoorwerp. Als de test artikel niet verspreid over het weefsel, schud de insert zachtjes van links naar rechts om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig wordt gedekt door de test artikel. Mechanische spreiding van de testartikelen (bijvoorbeeld met een pipet tip) wordt niet aanbevolen aangezien dit de weefsels beschadigen. Indien nodig, malen kristallijne poeders met een vijzel en stamper om beter contact tussen het testvoorwerp en het weefsel te garanderen. Als alternatief, plaats poeders direct op de weefselkweek in de insert met behulp van een 1 ml spuit met zijn kop afgesneden. Spul poeders in de spuit als de zuiger wordt getrokken terug en vervolgens toepassen door op de zuiger naar beneden. Wanneer de buitenwand van het inzetstuk contaminated bijvoorbeeld door poeders, veeg de deeltjes af met een steriel gaasje. Na het doseren, terug het weefsel de 6-well platen met kweekmedium en incubeer bij SCC gedurende 6 uur ± 15 min. 5. Spoelen Bereid een reeks van drie schone bekers (150 ml) per test artikel en vul elk van hen met 100 ml DPBS. Voor elke test artikel, maken gebruik van een andere set van drie bekers. Aan het einde van de 30 ± 2 min blootstelling voor vloeibare stoffen of 6 uur ± 15 min belichting voor vaste stoffen, te verwijderen en de doseerinrichting niet gebruiken als het gebruikt werd. Til de inserts die het RHCE weefsel uit het medium door grijpen de bovenrand van de plastic 'kraag' met fijne tang. Gebruik gebogen pincet te hanteren en decanteren te vergemakkelijken. Spoel de weefsels twee tegelijk door het houden van de dubbele inserts samen met hun kragen behulp van een tang. Wees voorzichtig not naar de weefsels beschadigen met de tang. Giet de test artikelen of controles uit het weefsel oppervlak op een schone absorberend materiaal (papieren handdoek, gaas, enz.) Dompel de inserts in de eerste beker van DPBS, werveling in een cirkelvormige beweging in de DPBS gedurende ongeveer 2 seconden, til de inserts, zodat ze meestal worden gevuld met DPBS, en giet de vloeistof terug in de beker. Herhaal dit proces drie keer in de eerste beker. Spoel de inzetstukken in de tweede en derde bekers DPBS drie keer per dezelfde wijze. Decanteer de vloeistof die in het inzetstuk op het absorberende materiaal. Draai de insert om een ​​benaderende hoek van 45 ° (open einde naar beneden) en raak de bovenlip om het absorberende materiaal. Opmerking: Als het niet mogelijk is al het zichtbare testmateriaal verwijderen, geen verdere spoeling moet worden gedaan om weefselbeschadiging te voorkomen als gevolg van overmatig gebruik. 6. Post-weken Na het spoelen,onmiddellijk onderdompelen weefsels in 5 ml proefmedium eerder opgewarmd tot KT in een gelabelde 12-wells plaat. Incubeer de weefsels gedurende 12 ± 2 min voor vloeibare stoffen of 25 ± 2 min voor vaste materialen ondergedompeld bij kamertemperatuur om de verwijdering van alle resterende testartikel vergemakkelijken. 7. Post-incubatie Aan het einde van de post-Soak onderdompelingsperiode, giet het proefmedium uit de weefsels en dep inzetstukken op een absorberend materiaal. Breng de inserts in de gelabelde 6-wells plaat met 1 ml warm Assay Medium. Incubeer de weefsels voor 120 ± 15 min bij SCC voor vloeibare testmaterialen. Incubeer de weefsels voor 18 ± 0.25 uur bij SCC voor vaste testmaterialen. 8. MTT Levensvatbaarheid test – Dag 1 (Protocol voor vloeistoffen) en Dag 2 (Protocol voor Solids) Voer de MTT-test na de Post-incubatie van 12077; 15 min voor vloeistoffen en 18 ± 0.25 uur voor vaste stoffen, respectievelijk. Bereid 1,0 mg / ml MTT-oplossing en 0,3 ml aliquot van de oplossing in elk putje van een gelabelde 24-wells plaat. Gebruik de MTT commerciële kit (Tabel 5): 2 uur voor gebruik ontdooien de MTT concentraat bij KT. Combineer 2 ml van MTT concentraat en 8 ml van de MTT verdunningsmiddel 1,0 mg / ml MTT-oplossing leidt. Bewaar de MTT oplossing bij 4 ° C in het donker tot gebruik. Laat de MTT-oplossing voor meer dan 1 dag niet op te slaan. Aan het einde van het bericht Incubatie Verwijder elke insert van de 6-well plaat en zachtjes vlek op een absorberend materiaal. Plaats de inserts in de 24-wells plaat met 0,3 ml MTT-oplossing. Los eventuele luchtbellen gevangen onder de inserts. Incubeer de plaat gedurende 180 ± 10 min bij SCC. MTT extractie Na 180 ± 10 min incubatie in de MTT-oplossing, verwijder elke insertvan de 24-well plaat en dep de onderkant van het inzetstuk op een absorberend materiaal. Voor niet-kleurstof vloeistof testartikelen (ondergedompeld extractie): Breng de inserts in een gelabelde 24-wells plaat met 2,0 ml van een extractiemiddeloplossing (isopropanol), zodat het onderdompelt het inzetstuk. Voor vaste stoffen en vloeibare verfsoorten (niet-ondergedompelde extractie om verontreiniging van de extractiemiddeloplossing voorkomen): Breng de inserts in een gelabelde 6-wells plaat met 1,0 ml van de extractiemiddeloplossing (isopropanol), zodat het niet het inzetstuk dompelen. Opmerking: Voer dezelfde niet-ondergedompelde opvraging overeenkomstige negatieve en positieve controles. Dicht de platen (bijvoorbeeld met parafilm tussen de plaat deksel en bovenrand van de putjes of een standaardplaat sealer). Plaats de platen op een orbitale schudder plaat en schud gedurende 2 tot 3 uur bij RT om het MTT extraheren. Als alternatief, het uitvoeren van de winning O / N bij 2-876, C in het donker zonder schudden. Voor niet-kleurstof vloeistof testartikelen (ondergedompeld extractie): Aan het eind van de extractieperiode, giet de vloeistof uit elke steek weer in de put en gooi de inzetstukken met RHCE weefsels. Meng het extract bevat en hevel twee 200 pi aliquots in de geschikte putjes van een gelabelde 96-well plaat volgens de plaat configuratie (figuur 2). Voor vaste stoffen en vloeibare verfsoorten (niet-ondergedompelde extractie): Aan het eind van de extractieperiode, gooi het weefsel (de weefsels zorg ervoor dat niet doorboren). Voeg 1,0 ml van het extractiemiddel oplossing in elk putje van de 24-wells plaat met de oplossing geëxtraheerd uit de weefsels. Meng het extractiemiddel bevat en hevel twee 200 pi aliquots in de geschikte putjes van een gelabelde 96-well plaat volgens de plaat configuratie (figuur 2). Bepaal tHij optische dichtheid (OD) van de geëxtraheerde monsters bij een golflengte tussen 550 en 590 nm (moet verenigbaar zijn binnen een laboratorium) op een plaatlezer of een spectrofotometer. Bij troebele oplossingen extract gevolg van onoplosbare vaste stoffen, centrifuge oplossingen voorafgaand aan het meten van de OD (afkoelen de centrifuge tot 4 ° C om verdamping te voorkomen). In het geval spoelen verwijdert niet de test artikel (TA) en de TA interfereert met MTT-reductie, moeten aanvullende controles worden gebruikt. Zie gedetailleerd SOP te corrigeren voor reductie van MTT 16. Indien een TA blijkt te hebben, of kleur die kan samenwerken met de MTT metingen te ontwikkelen, moet een aanvullende test worden uitgevoerd om de hoeveelheid gebonden kleurstof te bepalen en vervolgens uit het weefsel geëxtraheerd. Verwijzen wij u naar een gedetailleerd SOP om te corrigeren voor gekleurde testartikelen 16. 9. Berekeningen voor Tissue levensvatbaarheid Test (tabel 6 en figuur 3) & #160; Algemene berekeningen Bereken de gemiddelde OD waarde van de blanco controleputjes (Blk OD) voor elk experiment. Trek OD Blk uit elk OD-waarde van hetzelfde experiment (Blk gecorrigeerde gegevens). Bereken het gemiddelde van de twee monsters voor elk weefsel (= gecorrigeerde OD). Bereken het percentage levensvatbaarheid van elk van beide repliceren weefsels voor elke controle- en testvoorwerp opzichte van de gemiddelde negatieve controle (100% controle). Levensvatbaarheid (%) = [gecorrigeerde OD behandelde weefsels / gecorrigeerde OD negatieve controle] x 100% Bereken het verschil van de levensvatbaarheid (de levensvatbaarheid verschil tussen twee duplo weefsels). Bereken de gemiddelde testvoorwerp levensvatbaarheid (TA levensvatbaarheid) en classificeren testvoorwerp volgens voorspellingsmodel. 10. voorspellingsmodel (figuur 3) Als de TA-behandelde weefsel levensvatbaarheid van> 60,0 opzichte NC-behandelde weefsel vANSPRAKELIJKHEID, etiketteren de test artikel als niet-irriterend (NI) (GHS geen categorie). Als de TA-behandelde levensvatbaarheid van het weefsel is ≤ 60,0 ten opzichte van NC-behandelde levensvatbaarheid van het weefsel, het etiket van de testartikel als irriterend (I) (GHS-categorieën 1 en 2). Opmerking: Het EIT testresultaten worden gekwalificeerd als beschouwd: het EIT NC OD> 0,8 en <2,5; de EIT PC levensvatbaarheid van het weefsel (%, betrokken op NC) is ≤50.0%; het verschil tussen de beide repliceren weefsels (NC, PC en testvoorwerp) is <20,0%.