Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties
Summary
Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.
Abstract
Neutrofielen, de meest voorkomende van witte bloedcellen in de menselijke circulatie, spelen een belangrijke rol bij de afweer tegen binnendringende micro-organismen. Bovendien neutrofielen spelen een centrale rol in de immuunbewaking van tumorcellen. Ze hebben het vermogen om tumorcellen te herkennen en te induceren tumorceldood hetzij door een cel contact-afhankelijke mechanisme met waterstofperoxide of door middel van antilichaam-afhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC). Neutrofielen met anti-tumor activiteit kunnen worden geïsoleerd uit perifeer bloed van kankerpatiënten en tumordragende muizen. De neutrofielen worden genoemd tumor meegevoerde neutrofielen (TEN) het onderscheiden van neutrofielen van gezonde proefpersonen of naïeve muizen die geen significante tumor cytotoxische activiteit vertonen. Vergeleken met andere witte bloedcellen, neutrofielen tonen verschillende drijfvermogen waardoor het mogelijk is om een> 98% zuivere populatie neutrofielen te verkrijgen wanneer onderworpen aan een dichtheidsgradiënt. Maar naastde normale hoge dichtheid neutrofielen populatie (HDN) bij kankerpatiënten, in tumordragende muizen, evenals onder chronische ontstekingsaandoeningen, verschillende low-density neutrofielen populaties (LDN) zijn opgenomen in de circulatie. LDN co-zuivert met de mononucleaire fractie en kan worden gescheiden van mononucléaire cellen met behulp van positieve of negatieve selectie strategieën. Wanneer de zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen wordt bepaald door flow-cytometrie, kunnen ze worden toegepast voor in vitro en in vivo functionele assays. We beschrijven technieken voor het bewaken van de antitumoractiviteit van neutrofielen, hun vermogen om te migreren en reactieve zuurstofsoorten te produceren, alsmede toezicht op hun fagocytische capaciteit ex vivo. We technieken beschrijven verder de neutrofielen in vivo traceeretiket en hun anti-metastatisch vermogen in vivo te bepalen. Al deze technieken zijn essentieel voor het begrip van het verkrijgen en karakteriseren neutrofielen met anti-tumorfunctie.
Introduction
Neutrofielen werden aanvankelijk gekarakteriseerd als het aangeboren immuunsysteem cellen die als eerste lijn verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Vandaag de dag is het bekend dat neutrofielen hebben verdergaande functies, betrokken zijn bij de montage van adaptieve immuunreacties tegen vreemde antigenen 1,2, het reguleren van hematopoiese 3, angiogenese 4 en wondgenezing 5. Daarbij mag neutrofielen tumorgroei en metastatische progressie beïnvloeden door hun pro- en anti-tumor activiteiten 6,7. Neutrofielen worden gekenmerkt door een polymorfe gesegmenteerde kern (vandaar aangeduid polymorfonucleaire (PMN) leukocyten) en ten minste drie verschillende subklassen van granules en secretorische blaasjes 8 (Figuur 1 A-C).
Neutrofielen hebben grote fagocytische capaciteit en hoge NADPH-oxidase activiteit essentieel is voor microbiële verwijdering en scheiden een groot aantal chemokinen belangrijk bijtraction extra neutrofielen en andere immuuncellen naar de plaats van ontsteking 8,9. Neutrofielen worden gekenmerkt door de expressie van een groot aantal oppervlaktereceptoren zoals Toll-achtige receptoren (TLRs), C-type lectine receptoren (CLRS), complement receptor 3 (CD11b / CD18) en andere adhesiemoleculen (bijvoorbeeld, L-selectine, LFA-1, VLA-4 en carcinoembryonaal antigen gerelateerde celadhesie molecuul 3 (CEACAM3 / CD66b)), chemokine receptoren (bijvoorbeeld, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), chemoattractant receptoren (bv PAFR, LTB 4 R en C5AR) , cytokine receptoren (bijvoorbeeld, G-CSFR, IL-1 R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptide receptoren (bv FPR1-3) en Fc-receptoren (bijvoorbeeld CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) en CD64 (FcyRI) 10. Bij muizen worden gewoonlijk geïdentificeerd als neutrofielen CD11b + Ly6G +, terwijl menselijke neutrofielen worden geïdentificeerd met de CD 11, CD15, CD16 en CD66b leukocyten markers. Ook wordt algemeen aanvaard kleur wordt de granule-eiwitten myeloperoxidase (MPO) en neutrofiel elastase (NE) voor detectie van neutrofielen in weefsels.
Het blijft onduidelijk of de diverse functies van neutrofielen worden gemedieerd door dezelfde cel of door afzonderlijke cel subpopulaties. Accumuleren gegevens wijzen op de aanwezigheid van een heterogene populatie neutrofielen die een hoge mate van plasticiteit die door pro-inflammatoire stimuli en hun micro 11,12 vertoont. Fridlender et al. 13 hebben schromelijk verdeelde de neutrofielen bij kanker in twee belangrijke subpopulaties genoemd N1 met anti-tumor eigenschappen en N2 met pro-tumor eigenschappen. Bij kanker, alsmede in chronische ontsteking, is er een extra subpopulatie uit granulocytic myeloide suppressor cellen (G-MDSCs) dat T-celresponsen 14 onderdrukken. G-MDSCs worden als onrijpe myeloïde cellen gekenmerkt door een CD11b + Ly6C zijnlage Ly6G hi fenotype in muizen 15, terwijl het hebben van een CD15 + / CD16 laag fenotype in de menselijke 16. G-MDSCs uiten hogere niveaus van arginase en myeloperoxidase, terwijl lagere niveaus van cytokines en chemokines dan normaal circulerende neutrofielen. Ze zijn minder fagocytische en trekvogels, maar produceren hogere niveaus van ROS 15,17,18. In dit document zullen we een aantal fundamentele methoden voor isolatie en karakterisering van neutrofielen met anti-tumor eigenschappen te beschrijven.
Terwijl neutrofielen vormen de grootste bevolking van alle witte bloedcellen in het menselijk omloop (45-70%; 1800 – 6000 / ul), bij muizen, onder normale omstandigheden, ze zijn nogal mager (10 – 15%; 300-500 / ul ). De neutrofielen stijgt gestaag op ontstekingen en soms met kanker, die een toestand van chronische ontsteking 7 vertegenwoordigt. Neutrofielen ontwikkelen van multipotent gemeenschappelijke myeloïde voorloper (CMP) cells in het beenmerg, door een differentiatieproces passeren van de fasen van myeloblasten (MB), promyelocyten (PM), myelocyten (MC), metamyelocyten (MM) en band cellen (BC) 8. De volwassen, post-mitotische neutrofielen kan binnen het beenmerg blijven voor 4 – 7 dagen voordat ze worden vrijgegeven aan de circulatie 8. Neutrofielen omzet in het bloed is gewoonlijk snel met een gemiddelde halfwaardetijd van 6-12 uur, eventueel verlengd onder ontstekingsaandoeningen. Gestimuleerde neutrofielen hebben anti-tumorigene activiteit, een functie die kan worden verworven door het blootstellen van de naïeve neutrofielen naar de chemokinen IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 en CXCL5 6,19 of kunstmatig beperkt door ze bloot te stellen aan de forbolester forbol 12 -myristate 13-acetaat (PMA) 6.
De korte halfwaardetijd van bloed neutrofielen samen met het lage aantal neutrofielen (~ 3-5 x 10 5) bereikt van 1 ml bloed van een naïeve 6-8 weken oude muis, hebben het gemaaktmoeilijk om de functie van circulerende neutrofielen muis in vitro onderzoeken. Om deze moeilijkheid te overwinnen, zijn andere bronnen gebruikt. Zo kunnen grote aantallen neutrofielen worden verkregen uit het beenmerg 20 of het peritoneum volgend op de inductie van steriele ontsteking (bijvoorbeeld na intraperitoneale injectie van thioglycolaat cultuurvloeistof of Zymosan A). Opgemerkt wordt dat neutrofielen verkregen uit de peritoneale holte geen anti-tumorontwikkeling (ongepubliceerde waarneming) uitoefenen.
. Granot et al opgemerkt dat 6 BALB / c muizen geïnoculeerd met orthotopically de muis 4T1 borstcarcinoom cellijn ontwikkelen neutrofilie die verergert tot tumorprogressie 6 (figuur 2A), zodat 20-40000000 bloedneutrofielen gemakkelijk worden geïsoleerd uit 1 ml bloed 3-4 weken na de tumor-inoculatie. Deze neutrofielen hebben anti-tumor activiteiten verworven, en hebben daarom COI geweestned-tumor meegevoerde neutrofielen (TEN), teneinde deze te onderscheiden van naïeve neutrofielen 6 (Figuur 2B). Terwijl high-density neutrofielen (HDN figuur 1A) sterk anti-tumorigene, low-density neutrofielen (LDN figuur 1B) gegenereerd in de context van kanker niet 21. Ook, high-density neutrofielen uit het beenmerg en de milt van tumordragende muizen anti-tumor activiteit (ongepubliceerde gegevens). Opgemerkt wordt dat bij tumorprogressie de milt geleidelijk vergroot (splenomegalie), met toenemende hoeveelheden van neutrofielen.
Opgemerkt wordt dat de TEN ook geproduceerd in andere modellen van kanker waaronder zowel spontane (MMTV-PyMT en MMTV-Wnt1 mammaire tumoren en k-Ras driven longtumoren) en geïnjecteerd (AT-3 (MMTV-PyMT) en E0771 borstcarcinoom cellen, LLC Lewis longcarcinoom cellen en B16-F10 melanoomcellen). De mate van neutrofiel mobilisatie in deze tumof modellen veel minder dan van 4T1-geïnoculeerde muizen, tot 5-10 x 10 6 neutrofielen in 1 ml bloed na 3 weken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neutrofielen zijn de meest voorkomende van witte bloedcellen en de eerste responders bij infecties en ontstekingen. Als zodanig zijn ze zeer gevoelig voor externe stimuli en zijn allemaal toegewezen. Bovendien neutrofielen een zeer korte halfwaardetijd en een hoge omloopsnelheid. Samen vormen deze elementen voeren een aantal problemen bij het werken met neutrofielen, zodat unieke experimentele strategieën nodig. Zo zijn er verschillende neutrofielen zuiveringsstrategieën, elk met zijn eigen voor- en nadelen.
<p cl…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ZG wordt ondersteund door subsidies van de I-CORE programma van de Israel Science Foundation (Grant No. 41/11), de Abisch-Frenkel Stichting, het Rosetrees Trust, het Israël Cancer Research Foundation (ICRF – Research Career Development Award) en de ZORG stichting. ZGF wordt ondersteund door subsidies van de Israël Cancer Research Foundation (ICRF – Research Career Development Award), Chief Scientist van het Israëlische Ministerie van Volksgezondheid en de Israël Lung Association.
Materials
| CELL LINES | |||
| Mouse 4T1 breast carcinoma cells | ADCC | CRL-2539 | Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS |
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| 24-well Tissue Culture Plate | Falcon | 353047 | Sterile |
| 100 mm Tissue Culture Plate | Corning | 430167 | Sterile |
| 25 cm2 Tissue Culture Flask | Nunc | 156340 | Sterile |
| 90 mm Bacterial Grade Culture Dish | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 20090-01-017 | Sterile |
| 15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835015-40-111 | Sterile |
| 50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835050-21-111 | Sterile |
| Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube | Becton Dickinson | 352058 | Sterile |
| Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm | Merck Millipore | PSMT010R1 | Sterile |
| White 96-Flat-Bottom Well Plate | Costar | 3917 | Sterile |
| Cell Strainer (40 mm) | BD Falcon | 352340 | Sterile |
| 20G 1.5" Needle | BD Microlance 3 | 301300 | Sterile |
| 23G 1" Needle | BD Microlance 4 | 300800 | Sterile |
| 25Gx5/8" Needle | BD Microlance 5 | 300600 | Sterile |
| 0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle | BD Micro-Fine Plus Demi | 320829 | Sterile |
| 9 mm Clips | BD, AutoClip | 427631 | Sterile |
| EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | Sterile |
| MidiMACS Separator Magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Microscope Glass Slide | Menzel-Gläser Superfrost Plus Thermo | J1800AMNZ | |
| Orbital Shaker | Sky line, ELMI | S-3.02.10L | |
| Plate Reader | TECAN | InfiniteF200Pro | |
| POWDER | |||
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Sigma | A7906 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | BD Pharmingen | 550891 | Sterile |
| CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) | Molecular Probes | C1157 | |
| Dextran T500 | Sigma | 31392 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma | S8032 | Highly toxic, handle with care |
| Thioglycollate powder | Difco | 225650 | |
| Zymosan A | Sigma | Z4250 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Sigma | D5796 | Sterile |
| Opti-MEM® I reduced serum medium | Life Technologies | 31985062 | Sterile |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | Sterile |
| Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated | Sigma | F9665 | Sterile |
| L-Glutamine | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-020-1A | Sterile |
| Sodium pyruvate | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-042-1B | Sterile |
| Penicillin Streptomycin x1000 solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-031-5 | Sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-1 | Sterile |
| PBSx10 without Ca2+ and Mg2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-5A | Sterile |
| HPLC grade water | J.T. Baker | 4218-03 | Autoclave |
| SOLUTIONS | |||
| ACK – Ammonium-Chloride-Potassium | Life Technologies | A10492-01 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS | Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter. | ||
| CFSE, 5 mM in DMSO | Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC. | ||
| Eosin Y solution | Sigma | HT110-2-32 | |
| Hanks' balanced salt solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Heparin, 20 mg/ml in PBS | Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| Histopaque-1119 | Sigma | 11191 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
| Luciferase cell culture lysis buffer x5 | Promega | E153A | Dilute 1:5 in sterile water just before use. |
| Luciferase assay solution | Promega | E1501 | Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A) |
| Mayer's Hematoxylin solution | Sigma | MHS-32 | |
| PBS+0.5% BSA | Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| PBS+1% BSA | Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| 5x PBS with 2.5% BSA | Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| Saline (0.9% NaCl) | Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
| 0.2% NaCl solution | Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
| 1.6% NaCl solution | Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
| 2 % Sodium azide | Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic. | ||
| 3% Thioglycollate solution | Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw. Boil until solution becomes yellow and autoclave. | ||
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution. |
| Trypsin solution B | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-046-1 | Sterile |
| 1 mg/ml Zymosan A | Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use. | ||
| KITS | |||
| EasySep PE selection kit | STEMCELL Technologies | 18557 | |
| EasySep PE selection cocktail | STEMCELL Technologies | 18151 | |
| the EasySep magnetic nanoparticles | STEMCELL Technologies | 18150 | |
| Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-332 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19762 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19257 | |
| FITC BrdU flow kit | BD Pharmingen | 559619 | |
| MACS Neutrophil isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-097-658 | |
| Phagocytosis Assay Kit | Cayman Chemical Company | 500290 | |
| ANTIBODIES | |||
| FcR blocking antibody | Biolegend | 101302 | |
| Purified rat anti-Ly6G antibody | BD Pharmingen | 551459 | Clone 1A8 |
| PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody | Biolegend | 127608 | Clone 1A8 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G | BD Pharmingen | 551460 | Clone 1A8 |
| PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 65-1276 | Clone 1A8 |
| violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 75-1276 | Clone 1A8 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b | BD Pharmingen | 553310 | Clone M1/70 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) | BD Pharmingen | 553127 | Clone RB6-8C5 |
| PE-conjugated rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 553081 | Clone 30-F11 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80 | Abcam | ab60343 | Clone BM8 |
| FITC-conjugated mouse anti-human CD66b | Biolegend | 305103 | Clone G10F5 |
| Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k) | BD Pharmingen | 553927 | Clone R35-95 |
| LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11 |
References
- Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
- Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
- Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
- Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
- Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
- Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: ‘N1’ versus ‘N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
- Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
- Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
- Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
- Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
- Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
- Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).
