Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura
Summary
The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.
Abstract
Il trasferimento adottivo di cellule T specifiche per patogeno può essere usato per prevenire e curare le infezioni opportunistiche come il citomegalovirus (CMV) che si verificano dopo il trapianto allogenico di cellule staminali. Cellule T specifiche virali-da donatori allogenici, compresi donatori di terze parti, possono essere propagati ex vivo in conformità con le attuali buone prassi di fabbricazione (cGMP), impiegando ripetuti cicli di stimolazione antigenica-driven per propagare selettivamente le cellule T desiderate. L'identificazione e l'isolamento di cellule T antigene-specifiche possono essere effettuati anche in base al sistema di acquisizione di citochine di cellule T che sono state attivate a secernere gamma-interferone (IFN-γ). Tuttavia, diffusa applicazione umana del sistema di cattura di citochine (CCS) contribuire a ripristinare l'immunità è stata limitata come il processo di produzione richiede tempo e richiede un operatore esperto. Lo sviluppo di un dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione come CliniMACS Prodigy oraconsente agli investigatori di generare cellule T specifiche virali-con un sistema ad alta intensità di manodopera automatizzato, meno. Questo dispositivo separa magneticamente etichettati cellule dalle cellule senza etichetta utilizzando la tecnologia magnetica ordinamento delle cellule attivate per generare prodotti ad uso clinico, è stato progettato come un sistema chiuso e si può accedere e gestito sul banco. Abbiamo dimostrato il funzionamento di questo nuovo dispositivo arricchimento delle cellule automatizzato per la fabbricazione di cellule T specifiche per CMV pp65 ottenute da un prodotto aferesi stato stazionario ottenuto da un donatore sieropositivo CMV. Queste cellule T isolate possono essere infuse direttamente in un paziente sotto la supervisione regolamentare istituzionale e federale. Tutte le fasi bio-trattamento compresi rimozione dei globuli rossi, la stimolazione di cellule T, la separazione delle cellule T antigene-specifiche, purificazione e lavaggio sono completamente automatizzati. Dispositivi come questo sollevano la possibilità che le cellule T per applicazioni sull'uomo possono essere realizzati al di fuori di buone pratiche di fabbricazione dedicato (GMP) Strutture e invece essere prodotti in sangue servizi bancari in cui il personale può supervisionare protocolli automatizzati per la produzione di più prodotti.
Introduction
Il trapianto di cellule emopoietiche staminali (HSCT) 1 può essere combinato con la terapia delle cellule T adottiva per migliorare effetto graft-versus-tumorale e per fornire l'immunità alle infezioni opportunistiche 2. Generazione di linfociti T del donatore-derivato antigene-specifiche per infusione è storicamente richiesto personale specializzato e l'uso di strutture specializzate che sono GMP. La consegna di tali cellule T ha portato alla risoluzione di infezioni opportunistiche 3 e trattare il tumore di base 4. Recentemente, i ricercatori hanno dimostrato che il trasferimento adottivo di solo poche migliaia di cellule T virus-specifici (~ 1 x 10 4-2,5 x 10 5 cellule / kg di peso corporeo destinatario) in grado di trattare con successo le infezioni opportunistiche da CMV dopo HSCT allogenico 5-9. Un numero limitato di strutture GMP con relative esigenze produttive qualificati e gli alti costi associati con la produzione delle cellule ha, tuttavia, Restrl'accesso dei pazienti alle itto promettenti terapie delle cellule T 10. Un approccio per isolare le cellule T antigene-specifiche è basata su CCS utilizzando un reagente specifico bi-riconoscere CD45 e IFN-γ. Come mostrato, questa metodologia può essere utilizzato per generare uso clinico cellule T specifiche per CMV impiegano un dispositivo di arricchimento delle cellule automatizzato CCS (Figura 1B).
Cellule T specifiche per CMV sono generate incubando peptidi sovrapposti da pp65 CMV con le cellule leucoaferesi totale nucleari (TNC) da donatori CMV positivi. Questi peptidi, visualizzate nel contesto di leucociti antigene umano (HLA), attivare le cellule T specifiche CMV-PP65 nel TNC a secernere IFN-γ. Queste cellule T possono essere "catturati" e magneticamente separati. Il funzionamento del dispositivo di arricchimento delle cellule prima generazione (Figura 1A) richiesto personale specializzato in coltura in condizioni di GMP e coordinamento del personale di intraprendere le molteplici sTeps necessario generare un prodotto "catturato".
La procedura di richiesta tipicamente 10-12 ore di funzionamento continuo, e quindi il personale probabilmente bisogno di lavorare su due turni nella struttura GMP. Questi vincoli sono ora ovviato con l'attuazione di un dispositivo di seconda generazione (Figura 1B). Questo dispositivo si impegna arricchimento magnetico, simile al dispositivo di prima generazione, ma automatizza altri aspetti delle CCS in un approccio unbreached. Questo riduce notevolmente l'onere per la squadra GMP come la maggior parte delle fasi può essere realizzato senza sorveglianza da parte del personale. Inoltre, poiché il dispositivo opera come un sistema chiuso, le cellule T antigene-specifiche possono essere acquisiti e processati sul banco tranne le fasi isolatamente leucaferesi e preparazione dei materiali prima di avviare lo strumento. Dettagli della strumentazione completa e la funzionalità del dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione sono stati pubtuito 11.
Qui, descriviamo la procedura per arricchire le cellule T specifiche per PP65 CMV da un prodotto aferesi steady-state utilizzando il sistema automatizzato CCS arricchimento delle cellule. Una volta isolato, queste cellule T specifiche per CMV possono essere immediatamente infuso in un paziente.
Protocol
Representative Results
Discussion
La terapia delle cellule T adottiva è emersa come una valida opzione per il trattamento di tumori a cellule B 4. Il suo potenziale terapeutico dipende infondendo il numero desiderato di specifiche cellule T antigene bersaglio privi replicativa senescenza 2. Ciò può essere ottenuto da sistemare una popolazione pura di cellule T specifiche antigene da cellule T espanse le vigenti buona fabbricazione. Due procedure di smistamento sono ampiamente utilizzati, vale a dire, la fluorescenza delle cellul…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.
Materials
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 mL Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
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