Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri
Summary
We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.
Abstract
Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.
Introduction
Geleneksel aşı geliştirme ağırlıklı deneme-yanılma ampirik bir yaklaşım uygulamaktadır. Ancak, biyomalzeme ve immün aktivasyon moleküler belirleyicileri keşif geniş bir yelpazeye son gelişme ile, bu rasyonel patojenlerin 1,2 türetilen biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları ile aşı formülasyonları tasarlamak artık mümkün. Özellikle, çeşitli parçacık halinde ilaç iletim platformları, lenf içinde bulunan bozunmadan, aşı bileşenleri korumak ve antijen sağlayan hücrelere (APC) kendi eş sevkini iyileştirmek, bu alt birim antijen ve immünostimülatör maddelerle birlikte yüklenebilecek aşı taşıyıcıları olarak incelenmiştir düğümler (LN), böylece bağışıklık uyarımı ve aktivasyonunu 3-5 maksimize. Daha önce güçlü bir aşı platfor olarak gösterilmiştir, bu yazıda, bir "patojen taklit eden" nanopartikül sisteminin sentezini tarif adlandırılan interbilayer-çapraz bağlanmış çok-lamelli veziküller (ICMVs),Sağlam sitotoksik T lenfosit (CTL) ve sistemik ve mukoza dokusu bölümlerinde 6-9 hem de humoral bağışıklık karşılıklarının ortaya çıkartıldığını m. Özellikle, ICMVs ile aşılama büyük oranda geleneksel yardımcı maddeler (örneğin, şap ve Montanide) 7 ile aşılama ile karşılaştırıldığında, bir sıtma antijene karşı serum IgG düzeyleri gelişmiş ve aynı zamanda tümör hücreleri ve fareler 9 viral meydan modellerine karşı güçlü CTL yanıtları ortaya başararak. Burada bir model aşı nanoparçacık sistemi olarak ICMVs kullanarak, biz partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeli ölçümleri ve boşaltma LN parçacık ticareti izleme cryosectioned dokuların 7 konfokal görüntüleme kullanan (dLNs dahil) aşı nano-formülasyonlar karakterizasyonu için yöntemler açıklanmaktadır. Buna ek olarak, lusiferaz sentezleyen bir antijen-özgül CD8 + T hücrelerinin 9,10 adoptif nakli sonrasında farelerde CTL yanıtlarının genişleme analiz bir bütün hayvan görüntüleme tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. Son olarak biz denanopartiküller 6,9 ile aşılanmış farelerde endojen T hücresi tepkilerinin uzunlamasına ölçümü için periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), çizici tetramer boyaması.
ICMVs daha sonra kimyasal olarak çapraz bağlayıcı ditiyol 6 lipid tabakaları içinde çapraz bağlama maleimid-işlevselleştirilmiş fosfolipid baş grupları tarafından stabilize edilir çok katmanlı yapılar, içine basit lipozomlar kontrol füzyon tarafından sentezlenen bir lipid bazlı nanopartikül formülasyonu vardır. ICMVs sentez edildikten sonra, nano partiküllerin küçük bir kısmı parçacık boyutuna ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı (DLS) sistemi ve zeta potansiyeli analizcisi ile (parçacıkların, yani, yüzey yükü) belirlemek için kullanılabilir. Difüzyon katsayısı belirlenmesi ve parçacıkların 11 hidrodinamik boyutu izin parçacık süspansiyonları ışık saçılması DLS ölçer değişiklikler. Toplu sentezine toplu tutarlı parçacık büyüklüğü sağlanması önemlidirparçacık boyutu yana APCler 12,13 tarafından dLNs ve daha sonra hücre içine kabul edilmesine aşı parçacıkların lenf boşaltma etkileyen ana faktörlerden biridir. Buna ek olarak, zeta potansiyeli partikülleri ve partikül yüzey yükünün 11 elektroforetik hareketlilik belirlenmesini sağlayan bir elektrik akımı uygulanır parçacık hızını ölçerek elde edilebilir. Parçacıkların yüzey yükü depolama sırasında ve in vivo uygulama 14,15 sonra parçacık dağılım üzerinde doğrudan etkisi vardır koloidal istikrarı belirler çünkü parçacıkların tutarlı zeta potansiyeli değerlerin sağlanmasında çok önemlidir. DLNs partikül yerelleştirme izlemek amacıyla, ICMVs lipofilik boyalar ve kovalent etiketli antijenler de dahil olmak üzere istenilen floroforlar ile etiketli olabilir. Aşılamadan sonra, fareler, dLNs rezeke, çeşitli zaman noktalarında ötenazi cryosectioned ve konfokal mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu teknik lenfatik DraI görselleştirme sağlarnanoparçacık aşı taşıyıcıları ve dLNs antijenin hem eğirme. Daha önce 7 gösterildiği gibi doku bölümleri ilave olarak antijen ve germinal merkezlerin oluşumu ile bağlantılı hücre türleri gibi floresan etiketli antikorlar ve daha fazla bilgi elde etmek için kullanılan ile boyanmış olabilir.
Parçacık sentezi optimize edilmiştir ve dLNs insan ticareti onaylandıktan sonra, in vivo CTL genişleme aydınlatılması doğrulamak için önemlidir. Nanoparçacık aşılamaya verdikleri yanıt olarak antijene özgü CD8 + T hücrelerinin ortaya konmasını analiz etmek amacıyla, detaylı bir immünolojik analizler sağlar OVA 257-264 peptit (SIINFEKL) immünodominant CD8 + T hücre epitopu ile bir model antijen, ovalbümin (OVA) kullanmıştır Başlangıç aşı geliştirme 16,17 için antijen-spesifik T hücresi tepkilerinin. Özel olarak, genleşme ve antijene özgü CD8 + T hücrelerinin göç dinamiklerini sorgulamak için, biz oluşturulan adresT-hücresi reseptörü (H-2K ile birlikte b) SIINFEKL için spesifik (TCR) ile CD8 + T hücreleri sahip OT-I transgenik farelerin transgenik fareler (Luc), lusiferaz sentezleyen ateşböceği geçerek çift transgenik fare modeli. Bu OT-I / Luc Farelerden, lusiferaz sentezleyen, OT-I, CD8 + T hücreleri, izole edilebilir ve saf C57BL / 6 farelerine adoptif transfer için hazırlanmıştır. Tohumlanmış sonra, OVA-içeren nanopartiküller ile başarılı bir aşı, bir bütün hayvan görüntüleme sistemi 9,10 ile biyoışıldama sinyalinin izlenmesi ile takip edilebilir şekilde nakledilen T hücrelerinin genişlemesine neden olur. Bu non-invazif tüm vücut görüntüleme tekniği uzunlamasına bir şekilde periferal dokularda T hücresi lenfoid dokularda genişleme ve yayılması ilgili işlemleri ifşa son 18-20 diğer viral veya tümör antijenleri ile kullanılmıştır.
Adoptif transfer antijene özgü CD8 + T hücre analizi, tamamlayıcı, endogenoBize T hücresi tepkileri kullanıldığında, aşılama dört florofor ile işaretlenmiş MHC-sınıf I molekülleri içeren bir peptit-MHC kompleksi tetramer, peptit epitopları ile yüklü olan peptid ana histokompatibilite kompleksi (MHC) tetramer denemesi 21 ile incelenebilir yayınlamak bir antijen-spesifik bir şekilde, TCR ve etiket, CD8 + T hücrelerini bağlamak için. peptid-MHC tetramer denemesi lenfoid ve periferik dokularda antijen spesifik CD8 + T hücrelerini teşhis etmek için, terminal Otopsi çalışmaları ya da seri kan çekilir elde edilen periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile uzunlamasına çalışmalarda da gerçekleştirilebilir. Peptid-MHC tetrameri ile lenfositlerin boyama sonra, akış sitometri analizine CD8 + T-hücreleri arasında kendi frekans CTL'lerin fenotipinde veya nicelenmesine detaylı analizler için gerçekleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede sağlanan protokol ICMVs olarak adlandırılan sentezi ve yeni bir lipid bazlı nanopartikül sisteminin karakterizasyonu açıklanmaktadır, ve antijene spesifik CD8 + T hücresi tepkilerini indükleme nanopartikül bazlı aşı formülasyonlarının etkinliğinin doğrulanması için bir işlem sağlar. ICMV sentezi genellikle kaybı ile sonuçlanan, tipik olarak hazırlanması için, organik çözücüler gerektiren diğer yaygın olarak kullanılan polimer nano partikül sistemleri (örneğin, p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü 1K22AI097291-01 hibe tarafından desteklenen ve Ödül Numarası UL1TR000433 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Translasyonel Bilimler ilerlemek için Ulusal Merkezi tarafından yapıldı. Biz de aşı nanopartiküller ve OT-I / Luc transgenik fareler üzerinde ilk çalışmaları katkılarından dolayı Fred Hutchinson Kanser Merkezi'nde MİT ve Prof. Matthias Stephan Prof. Darrell Irvine kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 mL glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125W/20kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo |
References
- Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
- Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
- Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
- Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
- Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
- Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
- DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
- Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
- Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
- Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
- Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
- Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
- Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
- Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
- Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
- Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771 (2012).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765 (2013).
- Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F., Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. , 476-502 (2009).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740 (2008).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
- Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
- Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
- Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
- Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
- Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
- Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
- Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
- Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
- Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
- Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
- Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
- Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
- Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
- Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
- Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105 (2013).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627 (2014).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).
