Ensaio Cometa mede quebras de DNA induzidas por diferentes fatores. Se todos os fatores (exceto estresse oxidativo) que causam danos ao DNA são mantidas constantes, a quantidade de dano ao DNA é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O objetivo deste protocolo é usar o teste do cometa para a medição indireta do estresse oxidativo.
Organismos eucarióticos superiores não podem viver sem oxigênio; No entanto, paradoxalmente, o oxigênio pode ser prejudicial para eles. A molécula de oxigênio é quimicamente inerte relativamente porque tem dois elétrons desemparelhados localizados em diferentes pi * anti-colagem orbitais. Estes dois elétrons têm spins paralelos, o que significa que gira na mesma direção sobre seus próprios eixos. É por isso que a molécula de oxigênio não é muito reativo. A activação de oxigénio pode ocorrer por dois mecanismos diferentes; ou através de redução por meio de um electrão de cada vez (monovalente redução), ou por meio da absorção de energia suficiente para inverter a rotação de um dos electrões desemparelhados. Isto resulta na produção de espécies oxidativas reactivas (ROS). Há um certo número de maneiras pelas quais o corpo humano elimina ROS no seu estado fisiológico. Se a produção de ROS excede a capacidade de reparação, os resultados de estresse oxidativo e danos moléculas diferentes. Existem muitos métodos diferentes pelos quais o estresse oxidativo pode estar measured. Este manuscrito incide sobre um dos chamados métodos de electroforese em gel de célula, também conhecido como "comet assay", que permite a medição das quebras de ADN. Se todos os factores conhecidos por causarem danos no ADN, à excepção de stress oxidativo são mantidas constantes, a quantidade de danos no ADN medida pelo ensaio do cometa é um bom parâmetro de estresse oxidativo. O princípio é simples e baseia-se no facto de que as moléculas de DNA são carregadas negativamente. Uma molécula de DNA intacto tem um tamanho tão grande que não migrar durante a electroforese. Quebras de ADN, no entanto, se estiverem presentes resultado em fragmentos mais pequenos, que se movem no campo eléctrico em direcção ao ânodo. Fragmentos menores migram mais rapidamente. À medida que os fragmentos têm diferentes tamanhos do resultado final da electroforese não é uma linha distinta, mas sim um contínuo com a forma de um cometa. O sistema permite uma quantificação do "cometa" resultante e, portanto, das quebras de ADN na célula.
Ensaio Cometa foi desenvolvido pela primeira vez por cientistas suecos Ostling e Johanson 1. O DNA é uma molécula carregada negativamente. Durante a eletroforese, fragmentos de DNA menores, danificadas viajar mais rápido em direção a um ânodo positivamente carregado 2. O menor dos fragmentos de ADN, mais rapidamente a sua migração para o ânodo, para formar um "cometa" típica com uma "cabeça" do composto intacto, o ADN intacto e uma "cauda" constituída por fragmentos de ADN danificadas 3. O DNA danificado pode ser reparado por diferentes mecanismos do corpo 4, que mantêm a geração de DNA breaks bastante equilibradas 5. Se, no entanto, o equilíbrio é a favor de quebras no ADN, as quebras podem acumular-se e, finalmente, contribuir para o desenvolvimento de uma doença.
O nosso DNA sofre danos aproximadamente 0.000165% em um determinado momento 6. Quebras de ADN de cadeia simples referem-se a um defeito de um dos dois cordões da dupla hélice de ADNConsiderando quebras de cadeia dupla de ADN são causados quando ambas as cadeias da dupla hélice de ADN são danificados. Existem vários factores que podem aumentar a quantidade de quebras no ADN em um determinado momento, tais como a idade da célula, o fumo do cigarro, várias drogas ou stress oxidativo 7-9. Se todos os fatores que levam a quebras de DNA aprimorados são mantidas constantes, em seguida, a quantificação de quebras de DNA por meio de teste do cometa é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo.
O método de ensaio do cometa é usado cada vez mais hoje em medicina incluindo oftalmologia. Uma razão para isto é que o stress oxidativo é cada vez mais reconhecido como um mecanismo patogénico para várias doenças e 8-11 comet assay é um método com o qual o stress oxidativo pode ser quantificada indirectamente.
Cientistas suecos Ostling e Johanson foram os primeiros em seu campo para usar ensaio cometa para quantificar o dano ao DNA em células de um. As condições neutras que os dois cientistas utilizado, no entanto, apenas foi possível a detecção de quebras de cadeia dupla de ADN. Singh et al., Depois adaptado o ensaio para o uso sob condições alcalinas, o que produziu uma versão sensível que poderia avaliar quebras duplas e ADN de cadeia simples e detectar sítios lábeis alcalino-12. Uma vez que o seu desenvolvimento inicial, o teste foi modificado em vários passos para torná-lo adequado para avaliar os tipos de danos no DNA em diferentes tipos de células 13-15.
Tal como acontece com todas as técnicas, prestando atenção rigorosa aos detalhes técnicos é importante para obter resultados precisos 16. Com base em nossa experiência, os melhores resultados são obtidos se cada passo da preparação metodológica solução para cometa quantificação-é realizada por especialista tecnol laboratórioicians. O uso de fresco e preparado corretamente mídia, técnicas de pipetagem adequadas, tempo exato e (como mencionado anteriormente na seção de resultados) o uso de leucócitos preparados na hora são essenciais para que a lise e eletroforese em gel para obter resultados precisos 17.
Todas as etapas individuais neste ensaio são igualmente importantes para a obtenção de resultados confiáveis. Em 16 melhores resultados gerais são obtidos se cada passo metodológico de preparação da solução até cometa quantificação é realizada por especialista technicians.Important laboratório parecem a utilização de meios frescos e preparados corretamente , técnicas de pipetagem adequadas, tempo exato e como já foi referido na seção de resultados do uso de leucócitos preparados na hora para lise e electroforese em gel para obter resultados adequados a partir do ensaio 17.
Como fazer outras metodologias, a técnica de ensaio do cometa tem sua advantages e desvantagens. Sendo um método sensível, o ensaio é vulnerável a factores (por exemplo, luz UV), que poderia aumentar quebras de DNA e, assim, afetar os resultados. Qualquer fator que pode aumentar o estresse oxidativo, exceto o que está sendo pesquisado, deve ser evitado. Factores de stress pode aumentar o nível de estresse oxidativo, não só em leucócitos, mas também em todos os outros meios e linfócitos sanguíneos. Como mencionado anteriormente, existem muitas maneiras diferentes e mais diretos de medição de estresse oxidativo 18,19. O ensaio do cometa é um dos muitos métodos que tem certas vantagens. Estes incluem o seu custo relativamente baixo, o pequeno número de células necessárias (<10.000 células) e, portanto, as pequenas amostras de sangue necessários por paciente, o período relativamente curto de tempo necessário para quantificar os danos no DNA em células (aproximadamente 3 dias), a sua sensibilidade e sua aplicabilidade generalizada a danos no DNA jumentos em diferentes tipos de células. No passado, nós escolhemos trabalhar com leucócitos desde que teve experiência com estedo tipo de célula e que era aplicável para o estudo particular planeada. Outra vantagem do ensaio de cometa é que ele pode ser utilizado para detectar diferentes tipos e níveis de danos no ADN e, portanto, pode ser aplicada em várias outras áreas para além dos estudos de stress oxidativo, tais como estudos de reparação de ADN, ensaios de complementação ou estudos de genotoxicidade.
O stress oxidativo é agora reconhecido como desempenhando um papel crucial na patogénese de várias doenças. O método de ensaio de cometa, enquanto uma das muitas maneiras de medir o stress oxidativo 18,19, é relativamente simples, barata e versátil. Quando dominado, este método pode ser usado em todas as áreas da medicina, em que o stress oxidativo desempenha um papel 8-10,20,21.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a LHW Stiftung, em Triesen, Liechtenstein, pelo apoio financeiro a nossa pesquisa sobre o estresse oxidativo.
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
Trizma Base | Spectrochem | ||
Materials required for gel electrophoresis | |||
Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
Methanol – Qualigens | |||
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides |