JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Анализ функций тучных клеток In Vivo с использованием 'Mast Cell Knock-in'Mice

Published: May 27, 2015
doi:
10.3791/52753
, , , , ,
1Department of Pathology,Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology,Stanford University School of Medicine

Summary

Мы описываем метод генерации в пробирке производных тучных клеток, их привитие в мачтовых клеток дефицитных мышей, а также анализ фенотипа, номера и распределение привитых тучных клеток на различных анатомических участках. Этот протокол может быть использован для оценки функций тучных клеток in vivo.

Abstract

Тучные клетки (MCs) гематопоэтические клетки, которые находятся в различных тканях, и особенно обильные в местах, подверженных внешней среде, таких как кожа, дыхательные пути и желудочно-кишечного тракта. Наиболее известный за их вредную роль в IgE-зависимых аллергических реакций, MCs также стали важными игроками в принимающей обороны от яда и вторжения бактерий и паразитов. На фенотип и функцию MC могут влиять микрооконденциальные факторы, которые могут отличаться в зависимости от анатомиального расположения и/или в зависимости от типа или стадии развития иммунных реакций. По этой причине мы и другие люди отдают предпочтение подходам in vivo, а не методам in vitro, чтобы получить представление о функциях MC. Здесь мы описываем методы генерации мышей костного мозга, полученных культурных MCs (BMCMCs), их приемной передачи в генетически MC-дефицит мышей, а также анализ чисел и распределения приемных переданы MCs на различных анатомических участках. Этот метод, названныйподходом «в нокаута тучных клеток», широко используется в течение последних 30 лет для оценки функций MCs и MC-производных продуктов in vivo. Мы обсуждаем преимущества и ограничения этого метода в свете альтернативных подходов, которые были разработаны в последние годы.

Introduction

Тучные клетки (MCs) гематопоэтические клетки, которые возникают из плюрипотентных прародителейкостного мозга 1-3. После регрессии костного мозга, прародители MCs мигрируют в различные ткани, где они развиваются в зрелые MCs под влияниемместных факторов роста 1-3. Ткань-резидентОВ MCs стратегически расположены на хост-среды интерфейсов, таких как кожа, дыхательные пути и желудочно-кишечного тракта, где они ведут себя как первая линия обороны от внешнихоскорблений 3-6. MCs часто субклассифицированы на основе их “базовых” фенотипических характеристик и их анатомические местоположения. У мышей были описаны два типа MCs: “соединительной ткани типа” MCs (CTMCs) и слизистых MCs (MMCs)1-3,7,8. КТК часто расположены вокруг венуле и вблизи нервных волокон, и проживают в серозных полостей, в то время как MMCs занимают внутрипителенные места в кишечнике и слизистой оболочкедыхания 1-3.

Многочисленные методологии были применены для изучения биологических функций MCs9-13. Многие группы сосредоточились на подходах in vitro, используя либо клеточные линии (такие как человеческие линии MC HMC114 или LAD215,16), в пробирке производных MCs (например, человека периферическойкрови, полученныхMCs 17 , или мыши костного мозга полученных культурные MCs (BMCMCs)18, фетальной кожи полученных культурных MCs (FSCMCs)19 и брюшной клетки полученных MCs (PCMCs)или ex vivo изолированных MCs из различных анатомических сайтов. Все эти модели широко используются для изучения молекулярных деталей биологии MC, таких как сигнальные пути, участвующие в активации MC. Однако важным аспектом биологии MCs является то, что их фенотипические и функциональные характеристики(например,содержание цитоплазмической гранулы или реакция на различные раздражители) могут быть модулированы анатомическим расположением и микроокнироницией2,7. Так как точная смесь таких факторов, которые встречаются in vivo может быть трудно воспроизвести in vitro, мы выступаем за использование in vivo подходов, чтобы получить представление о MCsфункции 9.

Существует несколько штаммов мыши с генетическим дефицитом MC, таких как широко используемые WBB6F1–Kit W/W-v или C57BL/6- Kit W-sh/W-sh мышей. Эти мыши отсутствие выражения и / или активности KIT (CD117), рецептор для основного фактора роста MC фактор стволовых клеток (SCF)21,22. В результате, эти мыши имеют глубокий дефицит MC, но и имеют дополнительные фенотипические аномалии,связанные с их c- комплект мутаций (в WBB6F1–Kit W / W-V мышей) или последствия большой хромосомной инверсии, что приводит к снижению C-комплект выражения (в C57BL/6-Kit W-sh/W-sh мышей) 9,10,23. Совсем недавно, несколько штаммовмышей с c-комплект-независимый составной дефицит MC былизарегистрированы 24-26. Все эти мыши и некоторые дополнительные новые типы неодобоваемых MC-дефицитных мышей были недавнорассмотрены в деталях 9,10,13.

Здесь мы описываем методы генерации полученных из костного мозга мышей культурных MCs (BMCMCs), их приемную передачу в MC-дефицитных мышей, а также анализ чисел и распределения приемных переданных MCs на различных анатомических участках. Этот так называемый метод стука “мачтовых клеток” может быть использован для оценки функций MCs и MC-производных продуктов in vivo. Мы обсуждаем преимущества и ограничения этого метода в свете альтернативных подходов, которые были разработаны в последние годы.

Protocol

Все операции по уходу за животными и эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения и с конкретным одобрением Институционального комитета по уходу за животными и использованию Стэнфордского университета. 1. П?…

Representative Results

Обзор ‘ мачтыячейки стук-в’ подход показан на рисунке 1, и включает в себя генерацию BMCMCs, количество клеток, которые должны быть engrafted i.p., i.d. или i.v. в MC-дефицит мышей (число может быть разнообразным, если указано на основе экспериментальной конструкции) и интервал между engraftment …

Discussion

Почти 30 лет после его первоначальногоописания 38, ‘мачты ячейки стук в‘ подход продолжает предоставлять ценную информацию о том, что MCs может сделать или не может сделать in vivo. Функции МС долгое время считалось ограниченным их ролью в аллергии. Данные, генерируемые с помощь…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Н.Г. является получателем стипендий от французской “Фонд за Recherche Medicale FRM” и Филипп фонда; R.S. поддерживается Фондом Люсиль Паккард по охране здоровья детей и Стэнфордским номером UL1 R025744; P.S. поддерживается стипендией Макса Кейд фонда Макса Кейд и Австрийской академии наук и стипендией Шрёдингера Австрийского научного фонда (FWF): J3399-B21; S.J.G. признает поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения грантов U19 AI104209, NS 080062 и от программы исследований заболеваний, связанных с табаком в Калифорнийском университете; Л.Л.Р. признает поддержку со стороны Национального исследовательского фонда артрита (ANRF) и Национального института здравоохранения грант K99AI110645.

Materials

1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30G x1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1 % Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as ‘tunable’ effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models – Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. ‘Sash’ mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Tags

Mast CellsIn VivoKnock-in MiceBone Marrow-derived Cultured Mast CellsAdoptive TransferAnatomical DistributionHost DefenseAllergic Reactions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using ‘Mast Cell Knock-in‘ Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image