JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
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Immunologie et infection

Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando 'Mast Cell Knock-in' Ratos

Published: May 27, 2015
doi:
10.3791/52753
, , , , ,
1Department of Pathology,Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology,Stanford University School of Medicine

Summary

Descrevemos um método para a geração de células de mastro derivadas in vitro, seu enenxerto em camundongos deficientes de células de mastro, e a análise do fenótipo, números e distribuição de células de mastro engrafadas em diferentes sítios anatômicos. Este protocolo pode ser usado para avaliar as funções das células de mastro in vivo.

Abstract

As células de mastro (MCs) são células hematopoiéticas que residem em vários tecidos, e são especialmente abundantes em locais expostos ao ambiente externo, como pele, vias aéreas e trato gastrointestinal. Mais conhecidos por seu papel prejudicial em reações alérgicas dependentes de IgE, os MCs também surgiram como atores importantes na defesa do hospedeiro contra veneno e bactérias invasoras e parasitas. O fenótipo e a função do MC podem ser influenciados por fatores microambientais que podem diferir de acordo com a localização anatômica e/ou com base no tipo ou estágio de desenvolvimento das respostas imunes. Por essa razão, nós e outros temos favorecido abordagens in vivo sobre métodos in vitro para obter insights sobre funções mc. Aqui, descrevemos métodos para a geração de MCs cultivados derivados da medula óssea do camundongo (BMCMCs), sua transferência adotiva para camundongos geneticamente deficientes em MC, e a análise dos números e distribuição de MCs adotivamente transferidos em diferentes locais anatômicos. Este método, chamado de abordagem de“knock-in” de células de mastro, tem sido amplamente utilizado nos últimos 30 anos para avaliar as funções de MCs e produtos derivados de MC in vivo. Discutimos as vantagens e limitações desse método, à luz de abordagens alternativas que vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos.

Introduction

As células de mastro (MCs) são células hematopoiéticas que surgem de progenitores pluripotentes da medula óssea1-3. Após a egressão da medula óssea, os progenitores de MCs migram para vários tecidos onde se desenvolvem em MCs maduros sob a influência de fatores de crescimento locais1-3. Os MCs residentes em tecidos estão estrategicamente localizados em interfaces de ambiente hospedeiro, como a pele, as vias aéreas e o trato gastrointestinal, onde se comportam como uma primeira linha de defesa contra insultos externos3-6. Os MCs são frequentemente sub-classificados com base em suas características fenotípicas “base” e suas localizações anatômicas. Em camundongos, dois tipos de MCs foram descritos: MCs (CTMCs) e MUCOSal MCs (MMCs)1-3,7,8. Os CTMCs são frequentemente localizados em torno de venules e fibras nervosas próximas, e residem em cavidades sorosais, enquanto os MMCs ocupam locais intraepiteliol no intestino e mucosa respiratória1-3.

Inúmeras metodologias têm sido aplicadas para estudar funções biológicas dos MCs9-13. Muitos grupos se concentraram em abordagens in vitro usando linhas celulares (como as linhas mc humanas HMC114 ou LAD215,16),MCs derivados in vitro (como MCs17derivados do sangue periféricos humanos ou M cultivados de medula óssea do rato CS [BMCMCs]18, MCs cultivados derivados da pele fetal [FSCMCs]19 e MCs derivados de células peritoneais [PCMCs]20) ou MCs isolados ex vivo de diferentes sítios anatômicos. Todos esses modelos são amplamente utilizados para estudar detalhes moleculares da biologia mc, como sinalizar caminhos envolvidos na ativação do MC. No entanto, um aspecto importante da biologia dos MCs é que suas características fenotípicas e funcionais (por exemplo,conteúdo de granase de grânulo citoplasmônico ou resposta a diferentes estímulos) podem ser moduladas por localização anatômica e microambiente2,7. Uma vez que a mistura exata de tais fatores que são encontrados in vivo pode ser difícil de reproduzir in vitro,favorecemos o uso de abordagens in vivo para obter insights sobre as funções de MCs9.

Existem várias cepas de camundongos com deficiência genética de MC, como os amplamente utilizados WBB6F1–Kit W/W-v ou C57BL/6-Kit W-sh/W-sh. Estes camundongos carecem de expressão e/ou atividade do KIT (CD117), o receptor para o principal fator de crescimento do MC fator de células-tronco (SCF)21,22. Como resultado, esses camundongos têm uma deficiência de MC profunda, mas também têm anormalidades fenotípicas adicionais relacionadas às suas mutações dekit c (nos camundongos WBB6F1–Kit W/W-v) ou aos efeitos da grande inversão cromossômica que resulta em expressão reduzida dokit C (no C57BL/6-Kit W-sh/W-sh mouses)9,10,12,23. Mais recentemente, várias cepas de camundongos comc-kit-deficiência de MC constitutivo independente foram relatadas24-26. Todos esses camundongos e alguns novos tipos adicionais de camundongos deficientes de MC indutíveis foram recentemente revisados em detalhes9,10,13.

Aqui, descrevemos métodos para a geração de MCs cultivados derivados da medula óssea do camundongo (BMCMCs), sua transferência adotiva para camundongos deficientes em MC, e a análise dos números e distribuição de MCs adotivamente transferidos em diferentes locais anatômicos. Este método chamado “mastro celular knock-in” pode ser usado para avaliar as funções de MCs e produtos derivados de MC in vivo. Discutimos as vantagens e limitações desse método, à luz de abordagens alternativas que vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos.

Protocol

Todos os cuidados e experimentações em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e com a aprovação específica do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Stanford. 1. Geração e Caracterização de Células de Mastros Cultivados Derivados da Medula Óssea (BMCMCs). Nota: Os BMCMCs doadores devem ser gerados a partir de células de medula óssea do mesmo fundo genético que os camund…

Representative Results

Uma visão geral da abordagem ‘mastro célula knock-in’ é mostrada na Figura 1, e inclui a geração de BMCMCs, o número de células que devem ser engrafadas i.p., i.d. ou i.v. em camundongos deficientes de MC (o número pode ser variado se indicado com base no design experimental) e o intervalo entre engraftment e experimento dependendo do local da injeção (este intervalo também pode variar, se indicado; por exemplo,o conteúdo dos mediadores armazenados em grânulos citoplasmoló…

Discussion

Quase 30 anos após sua descrição inicial38, a abordagem ‘mastro célula knock-in‘ continua a fornecer informações valiosas sobre o que os MCs podem ou não fazer in vivo. As funções dos MCs foram há muito tempo pensadas para se limitar ao seu papel na alergia. Os dados gerados usando a abordagem ‘mastro célula knock-in‘ mudaram essa visão, fornecendo evidências de que os MCs podem, entre outras funções, desempenhar papéis críticos na defesa do hospedeiro contra certos …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.G. é o beneficiário de bolsas da francesa “Fondation pour la Recherche Médicale FRM” e da Fundação Philipp; A R.S. é apoiada pela Lucile Packard Foundation for Children’s Health e pelo prêmio Stanford NIH/NCRR CTSA, número UL1 RR025744; P.S. é apoiado por uma Bolsa Max Kade da Fundação Max Kade e da Academia Austríaca de Ciências e uma Bolsa Schroedinger do Fundo Austríaco de Ciência (FWF): J3399-B21; S.J.G. reconhece apoio de institutos nacionais de saúde doem U19 AI104209, NS 080062 e do Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco na Universidade da Califórnia; L.L.R. reconhece o apoio da Fundação Nacional de Pesquisa da Artrite (ANRF) e dos Institutos Nacionais de Saúde doem K99AI110645.

Materials

1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30G x1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1 % Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03
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Citer Cet Article
Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using ‘Mast Cell Knock-in‘ Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).
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