تحليل وظائف الخلايا الصاري في فيفو باستخدام 'الصاري خلية طرق في' الفئران
Summary
نحن نصف طريقة لتوليد الخلايا الصاري المشتقة في المختبر ، وغرغرتها في الفئران التي تعاني من نقص الخلايا الصاري ، وتحليل النمط الظاهري والأرقام وتوزيع الخلايا الصارية المحتقنة في مواقع تشريحية مختلفة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم وظائف الخلايا السارية في الجسم الحي.
Abstract
الخلايا الصارية (MCs) هي خلايا دموية موجودة في أنسجة مختلفة ، وهي وفيرة بشكل خاص في المواقع المعرضة للبيئة الخارجية ، مثل الجلد والمسالك الهوائية والجهاز الهضمي. اشتهر دورهم الضار في الحساسية التي تعتمد على IgE ، كما ظهرت MCs كلاعبين مهمين في الدفاع المضيف ضد السم والبكتيريا الغازية والطفيليات. يمكن أن يتأثر النمط الظاهري ووظيفة MC بالعوامل المحيطة الدقيقة التي قد تختلف وفقا للموقع التشريحي و / أو استنادا إلى نوع أو مرحلة تطور الاستجابات المناعية. لهذا السبب، ونحن وآخرون قد فضلت في نهج في الجسم الحي على أساليب في المختبر للحصول على نظرة ثاقبة وظائف MC. هنا، نقوم بوصف طرق توليد المركبات متعددة الثقافات المشتقة من نخاع العظم (BMCMCs)، ونقلها بالتبني إلى فئران ناقصة وراثيا MC، وتحليل أعداد وتوزيع MCs المنقولة بالتبني في مواقع تشريحية مختلفة. وقد استخدمت هذه الطريقة ، التي تسمى‘الصاري خلية طرق في’ النهج ، على نطاق واسع على مدى السنوات ال 30 الماضية لتقييم وظائف الشركات متعددة الأجهزة والمنتجات المشتقة من MC في الجسم الحي. ونناقش مزايا هذه الطريقة وحدودها، في ضوء النهج البديلة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة.
Introduction
الخلايا الصارية (MCs) هي خلايا ما بين الهيماتوبوتية التي تنشأ من سلف نخاع العظم متعدد القدرات1-3. بعد خروج نخاع العظم، تهاجر السلف MCs إلى أنسجة مختلفة حيث تتطور إلى MCs ناضجة تحت تأثير عوامل النمو المحلية1-3. تقع MCs المقيمة في الأنسجة بشكل استراتيجي في واجهات البيئة المضيفة ، مثل الجلد والخطوط الجوية والجهاز الهضمي ، حيث تتصرف كخط دفاع أول ضد الإهانات الخارجية3-6. وغالبا ما تصنف الشركات متعددة الشخصيات على أساس خصائصها الظاهرية “الأساسية” ومواقعها التشريحية. في الفئران، تم وصف نوعين من MCs: “النسيج الضام من نوع” MCs (CTMCs) وMCs المخاطية (MMCs)1-3،7،8. غالبا ما تقع CTMCs حول النولس وبالقرب من الألياف العصبية ، وتقيم في تجاويف مصلية ، في حين تحتل MMCs مواقع داخل الظهارة في الأمعاء والغشاء المخاطي التنفسي1-3.
وقد طبقت منهجيات عديدة لدراسة الوظائف البيولوجية لمركبات الكربون المتعددة المركبات9-13. وقد ركزت مجموعات كثيرة على النهج في المختبر باستخدام خطوط الخلية إما (مثل خطوط MC الإنسان HMC114 أو LAD215,16), في المختبر MCs المستمدة (مثل الإنسان الطرفية المشتقة من الدم MCs17, أو نخاع العظام الماوس-MCs المستزرعة المشتقة [BMCMCs]18، MCs المستزرعة المشتقة من جلد الجنين [FSCMCs]19 و MCs المشتقة من الخلايا الصفاقية [PCMCs]20)أو MCs المعزولة من مواقع تشريحية مختلفة. وتستخدم جميع هذه النماذج على نطاق واسع لدراسة التفاصيل الجزيئية لبيولوجيا MC، مثل مسارات الإشارات المشاركة في تنشيط MC. ومع ذلك ، فإن جانبا هاما من بيولوجيا MCs هو أن خصائصها الظاهرية والوظيفية(على سبيل المثال، محتوى بروتياز الحبيبية السيتوبلازمية أو الاستجابة لمحفزات مختلفة) يمكن تحويرها حسب الموقع التشريحي والبيئة الدقيقة2،7. منذ الخليط الدقيق من هذه العوامل التي تواجهها في الجسم الحي قد يكون من الصعب إعادة إنتاج في المختبر، ونحن نفضل استخدام في نهج في الجسم الحي للحصول على رؤى في وظائف MCs9.
توجد عدة سلالات فأرة مع نقص MC الوراثي ، مثل WBB6F1المستخدم على نطاق واسع –كيت W / W-v أو C57BL /6 – كيت W-sh/W-sh الفئران. هذه الفئران تفتقر إلى التعبير و / أو نشاط KIT (CD117)، مستقبلات عامل نمو MC الرئيسي عامل الخلايا الجذعية (SCF)21،22. ونتيجة لذلك ، فإن هذه الفئران لديها نقص عميق MC ولكن لديها أيضا تشوهات إضافية فينوتيبيك تتعلق بطفراتهاc-kit (في WBB6F1–Kit W / W-v mice) أو بآثار الانعكاس الكروموسومي الكبير الذي يؤدي إلى انخفاض تعبيرc-kit (في C57BL/6 –Kit W-sh/W-sh mice)9,10,12,23. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن عدة سلالات من الفئران مع جعدة– المستقلة نقص MC التأسيسية24-26. وقد استعرضت مؤخرا كل هذه الفئران وبعض أنواع جديدة إضافية من الفئران MC ناقص غير قابل للانتقاص بالتفصيل9,10,13.
هنا، نقوم بوصف طرق توليد MCs المستزرعة المشتقة من نخاع العظم الماوس (BMCMCs)، ونقلها بالتبني إلى الفئران MC ناقصة، وتحليل أعداد وتوزيع MCs المنقولة بالتبني في مواقع تشريحية مختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة المسماة “طرق الخلايا السارية” لتقييم وظائف MCs والمنتجات المشتقة من MC في الجسم الحي. ونناقش مزايا هذه الطريقة وحدودها، في ضوء النهج البديلة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ما يقرب من 30 عاما بعد وصفها الأولي38،‘الصاري خلية طرق في’النهج لا يزال يقدم معلومات قيمة حول ما يمكن أن تفعله الشركات متعددة الشخصيات أو لا يمكن القيام به في الجسم الحي. كان يعتقد منذ فترة طويلة أن وظائف MCs تقتصر على دورها في الحساسية. البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام‘الصار…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N.G. هو المستفيد من الزمالات من الفرنسية “مؤسسة من أجل Recherche Médicale FRM” ومؤسسة فيليب; R.S. تدعمها مؤسسة لوسيل باكارد لصحة الطفل وجائزة ستانفورد NIH/NCRR CTSA رقم UL1 RR025744; 20- وتحظى شهادة البكالوريوس بدعم من زمالة ماكس كادي من مؤسسة ماكس كادي والأكاديمية النمساوية للعلوم وزمالة شرودينغر من الصندوق النمساوي للعلوم: J3399-B21؛ وزمالة شرودينغر من صندوق العلوم النمساوي( FWF): J3399-B21؛ S.J.G. تعترف بدعم المعاهد الوطنية للصحة منح U19 AI104209, NS 080062 ومن برنامج أبحاث الأمراض المرتبطة بالتبغ في جامعة كاليفورنيا; L.L.R. يعترف بدعم من مؤسسة البحوث الوطنية لالتهاب المفاصل (ANRF) والمعاهد الوطنية للصحة منحة K99AI110645.
Materials
| 1% Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning cellgro | 30-004-Cl | |
| 3 ml Syringe | Falcon | 309656 | |
| 35 mm x 10 mm Dish | Corning cellgro | 430588 | |
| 5 ml Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | 352058 | |
| Acetic Acid Glacial | Fisher Scientific | A35-500 | |
| Alcian Blue 8GX | Rowley Biochemical Danver | 33864-99-2 | |
| Allegra 6R Centrifuge | Beckman | ||
| Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified | eBioscience | 14-0161-81 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522 | |
| BD 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles | BD Precision Glide Needle | 205155 | |
| BD 25G 5/8 Needles | BD Syringe | 305122 | |
| BD 30G x1/2 Needles | BD Precision Glide | 305106 | |
| Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352097 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cytoseal 60 Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Cytospin3 | Shandon | NA | |
| DakoCytomation pen | Dako | S2002 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Corning cellgro | 15-013-CM | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E 7023-500ml | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma Aldrich | F4135-500ml | |
| FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control | eBioscience | 14-4031-82 | |
| Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) | eBioscience | 11-1171-82 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Giemsa Stain Modified | Sigma Aldrich | GS-1L | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| May-Grunwald Stain | Sigma Aldrich | MG-1L | |
| Multiwell 6 well plates | Falcon | 35 3046 | |
| Olympus BX60 Microscope | Olympus | NA | |
| Paraplast Plus Tissue Embedding Medium | Fisher Brand | 23-021-400 | |
| PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control | eBioscience | 12-4888-81 | |
| Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) | eBioscience | 12-5898-82 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | eBioscience | 00-6990-50 | |
| Recombinant Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Safranin-o Certified | Sigma Aldrich | S8884 | |
| Tissue culture flasks T25 25 cm2 | Beckton Dickinson | 353109 | |
| Tissue culture flasks T75 75 cm2 | Beckton Dickinson | 353110 | |
| Toluidine Blue 1 % Aqueous | LabChem-Inc | LC26165-2 | |
| Recombinant Mouse SCF | Peprotech | 250-03 |
References
- Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
- Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
- Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
- Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
- Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
- Galli, S. J. Mast cells as ‘tunable’ effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
- Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
- Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
- Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models – Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
- Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
- Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
- Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
- Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
- Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
- Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
- Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
- Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
- Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
- Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
- Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
- Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
- Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
- Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
- Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
- Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
- Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
- Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
- Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
- Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
- Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
- Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
- Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
- Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
- Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
- Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
- Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
- Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
- Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
- Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
- Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
- Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
- McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
- Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
- Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
- Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
- Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
- Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
- Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
- Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
- Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
- Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
- Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
- Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
- Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
- Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
- Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
- Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
- Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. ‘Sash’ mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
- Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
- Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).
