3D organotypisk co-kultur Model Støtte medullær thymusepitelmonolag celleproliferation, differentiering og Promiskuøs Gene Expression
Summary
Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein – a modified skin organotypic culture model – has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.
Abstract
Intra-thymus udvikling T-celle kræver en indviklet tredimensional meshwork sammensat af forskellige stromale celler, dvs. ikke-T-celler. Thymocytter krydse denne stillads i en meget koordineret tidsmæssig og rumlig orden, mens sekventielt passerer obligatoriske kontrolpunkter, dvs T-celle linie engagement, efterfulgt af T-celle receptor repertoire generering og udvælgelse inden udførsel i periferien. De to store resident celletyper danner denne stillads er corticale (cTECs) og medullære thymiske epitelceller (mTECs). Et centralt element i mTECs er den såkaldte promiskuøs udtryk for talrige væv-begrænset antigener. Disse væv-begrænsede antigener præsenteres for umodne thymocytter direkte eller indirekte af mTECs eller thymiske dendritiske celler henholdsvis resulterer i selv-tolerance.
Egnede in vitro-modeller emulerer de udviklingsmæssige veje og funktioner cTECs og mTECs øjeblikket lackonge. Denne mangel på tilstrækkelige eksperimentelle modeller har eksempelvis vanskeligt at analysere promiskuøs genekspression, som stadig dårligt forstået på det cellulære og molekylære niveau. Vi tilpasset et 3D organotypisk co-kultur model til kultur ex vivo isolerede mTECs. Denne model blev oprindeligt udviklet til at dyrke keratinocytter på en sådan måde, at generere en hud ækvivalent in vitro. 3D-modellen bevarede centrale funktionelle funktioner i MTEC biologi: (i) spredning og terminal differentiering af CD80 lo, Aire-negative i CD80 hi, Aire-positive mTECs, (ii) lydhørhed over for RANKL, og (iii) vedvarende udtryk for FoxN1, Aire og væv-begrænset gener i CD80 hi mTECs.
Introduction
Udviklingslande thymocytter udgør omkring 98% af thymus, mens de resterende 2% består af en række celler, der tilsammen komponere thymiske stroma (dvs. epithelceller, dendritiske celler, makrofager, B-celler, fibroblaster, endotheliale celler). De ydre corticale epithelceller (cTECs) skaffe indvandring af pro-T-celler fra knoglemarven, T-celle afstamning induktion i multipotente præ-T-celler og positiv selektion af selv-MHC-begrænset umodne thymocytter. De indre medullære thymiske epitelceller (mTECs) er involveret i tolerance induktion af disse thymocytter med en høj affinitet TCR for self-peptid / MHC-komplekser ved enten at inducere negativ selektion eller deres afvigelse ind i T regulerende celle afstamning. I forbindelse med centrale tolerance induktion, mTECs er unikke i, at de udtrykker et bredt spektrum af væv-begrænset selv-antigener (TRA'ER) således spejling den perifere selv. Dette fænomen kaldes promiskuøs genekspression (pGE)1,2.
De fleste nuværende undersøgelser af denne fascinerende celletype stole på ex vivo isolerede celler, som forskellige kortfristede 2D dyrkningssystemer resulterede uvægerligt i tab af pGE og nøgleregulator molekyler ligesom MHC-klasse II, FoxN1 og Aire inden for de første 2 dage 3-6 . Det forblev dog uklart, hvilke særlige komponenter og funktioner i intakte 3D meshwork af thymus manglede i 2D-modeller. Re-aggregation thymus organkultur (RTOC) den har været hidtil eneste 3D system, der tillader undersøgelse af T-celle-udvikling på den ene side og stromal cellebiologi, på den anden side, i en intakt thymisk mikromiljø 7. Men RTOCs har visse begrænsninger, dvs., de allerede indeholder en kompleks blanding af celler, kræver input af føtale stromaceller og udholde en maksimal periode på 5 til 10 dages dyrkning.
Manglen på reduktionistiske in vitro dyrkningssystemer har hæmmet studiet afflere aspekter af T-celle udvikling og thymus organogenese ikke mindst den molekylære regulering af pGE og dens forhold til den udviklingsmæssige biologi mTECs.
På grund af den close-slægtskab af den strukturerede tilrettelæggelse af epitelceller af hud og thymus, vi har valgt en 3D organotypisk kultur (OTC) system, der var blevet udviklet oprindeligt at efterligne differentieringen af keratinocytter in vitro og dermed skabe en dermal tilsvarende. OTC-systemet består af en inert stillads matrix overlejret med dermale fibroblaster, der er fanget i en fibrin-gel, hvorpå keratinocytter udsås 8,9. Her har vi erstattet keratinocytter med oprensede mTECs. Mens du holder de grundlæggende funktioner i denne model, vi optimeret visse parametre.
I det vedtagne OTC model mTECs spredt, undergik terminal differentiering og vedligeholdt MTEC identitet og pGE, således tæt efterligne in vivo mTECs udvikling <sup> 10. Denne tekniske notat giver en detaljeret protokol tillader trinvis opsætning af brissel OTC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sideløbende RTOCs har 3D OTC været langt overlegen i forhold til TEC differentiering og pGE vedligeholdelse / induktion (tabel 1) i forhold til andre (i) »forenklede 3D-kulturer 'med – fibroblaster alene uden stillads; (Ii) 2D systemer, der anvender – fibroblaster / feeder-celler co-dyrket med TECs 10, (iii) 3T3-J2 celler, hvor TEC kloner udvikle, men pGE er tabt, (iv) matrigel eller (v) ECM komponenter (upublicerede data). PGE blev opretholdt i op til 7 dage i 3D OTC, fire dage bliver…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.
Materials
| Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
| CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
| CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
| Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
| CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
| Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
| Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
| 12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
| 12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
| Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
| Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
| PBS | Serva | 47302.03 | |
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
| HEPES | Gibco | 15630-049 | |
| FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
| Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
| Cholera toxin | Biomol | G117 | |
| Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
| TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
| RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
| Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
| OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
| Trizol (aka. Denaturing solution – Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
| FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
| Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
| Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
| DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
References
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).
- Bonfanti, P., et al. Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells. Nature. 466, 978-982 (2010).
- Kont, V., et al. Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens. Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Stark, H. J., et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).
- Boehnke, K., et al. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells. Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).
- Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).
- Stark, H. J., et al. Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture. Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).
- Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts. J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).
