マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス
Summary
Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.
Abstract
Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.
Introduction
解剖パストレースは、脳と行動1との間の関係を解読するための最も一般的に使用さツールの一つです。神経回路のトレース技術の進歩は、マウス2における遺伝的に特定されニューロン集団から神経回路をトレースする能力を持つ神経科学を授けている。これらの技術的進歩にもかかわらず、それは特に、胚成熟中の神経回路の形成を解明するために依然として厳しい。現在までに開発さトレースの方法の多くは経シナプストレーサーまたは遺伝的に改変された神経向性ウイルスの定位注射（ 図1）2,3に基づいているためである。これらの技術は、発達中の脳、注射部位の再現性、注射部位の電位の炎症と最もimporに、接続性の空間的および時間的分解能を達成するような技術的に困難なトレーサー注射などのいくつかの固有の制限ものの神経向性ウイルスによるtantlyの細胞毒性は、それらの使用4を制限する。
別の方法は、遺伝子改変マウスでの導入遺伝子として経シナプストレーサーを表明することにある。我々は最近、この手法を変更し、すべての遺伝的に特定されニューロン集団5の神経回路をマッピングするために、バイナリ遺伝経シナプストレーシングシステムを開発した。 Cre介在した後に私たちの実験的な戦略は、双方向のトレーサー大麦レクチン（BL）6またはROSA 26座からGFP（GTT）7に融合した逆行性トレーサー破傷風毒素フラグメントCのいずれかを発現する二つの新しいノックインマウス系統に基づいており、再結合。ここでは、選択的にキスペプチンを作る神経細胞のBLとGTT、生殖軸8,9の成熟の調節に関与している神経ペプチドを表現するために、これらのマウス系統を使用していました。我々は、この技術は、キスの発達および成熟を可視化するために適していることを証明する雌マウスの脳5の胚発生時にpeptin神経回路。
育種戦略
R26-BL-IRES-τlacZ（BIZ）とR26-GFP-TTC（GTT）トレーサーラインがノックインされた組換えROSA26対立遺伝子を運ぶ菌株5。 R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子は、2つのloxP部位5が隣接している強力な転写停止信号の存在に転写的に沈黙している。 BIZとGTT導入遺伝子の発現は、転写停止信号のCre媒介除去により活性化される。 R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子は、単にのCreドライバラインと交配することによって独立して使用することができる。分析動物についてそれぞれCreおよびR26対立遺伝子についてヘテロ接合を使用することができる。 1 のCreまたは1 R26対立遺伝子を有する同腹仔は、それぞれ、対照として使用されるべきである。あるいは、トンを生成することも可能であるノックインriple のCre、R26-BIZとR26-GTT対立遺伝子を有する動物が、これは一つの追加のクロスが必要になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
遺伝的に定義されたニューロン集団の神経回路をトレースする導入遺伝子として経シナプストレーサーを発現するトレーサーまたはneurotopicウイルスの定位注射と比較していくつかの利点を有する。まず、トレーサーは、内因性タンパク質として産生されるので、任意の免疫応答を誘発しないと選択的な神経経路は、再現性の高い別の動物で分析することができる。これは、非侵襲的な方法で…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Michael Candlish for critical comments on the manuscript. This project was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft grants BO1743/6 and SFB/TRR 152 P11 and Z02 to Ulrich Boehm.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye) | Sigma | 14530-100MG | |
| Ethanol | Sigma | 32205-1L | |
| Cryo mold (Peel-a-way) | Polyscience Inc. | 18646A-1 | 22mm x 22mm x 20mm |
| DMSO | Sigma | D8418-100ML | |
| Dimethyl Formamide (DMF) | VWR Chemicals | 23470,293 | |
| EGTA | ROTH | 3054.3 | |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882-50ML | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 34988-7 | |
| Isopentane (Methyl 2-butane) | Sigma | M32631-2.5L | |
| Kaiser's Glycine gelatin | Merck | 1092420100 | |
| Methanol | Sigma | 494437-1L | |
| MgCl2 | Sigma | M2670-100G | |
| NaCl | ROTH | HN00.2 | |
| NBT | Sigma | 298-83-9 | |
| Nonidet P40 substitute | Fluka | 743.85 | |
| OCT | Leica | 14020108926 | |
| PAP pen | Dako | S2002 | |
| Parafarmaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750-25G | |
| Sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
| Superfrost slides | Thermo Scientific | FT4981GLPLUS | |
| TSA kit | PerkinElmer | NEL700 | |
| TSA plus kit | PerkinElmer | NEL749A001KT | |
| Tris | ROTH | AE15.2 | |
| Triton-X 100 | ROTH | 3051.2 | |
| Tween 20 | ROTH | 9127.1 | |
| X-gal | ROTH | 2315.1 | |
| Cryostat | Leica | na | |
| Light microscope equipped with DIC imaging | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Fluroscence microscope | Zeiss | Axioskop2 equipped with Axio Vision software | |
| Photoshop | Adobe | PS6 | |
| Goat anti-WGA (recognizes BL) | Vector Laboatories | AS-2024 | |
| Biotinylayted horse anti-goat IgG | Vector Laboatories | BA-9500 | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboatories | BA-1000 | |
| Rabbit anti-GFP (recognizes GTT) | Invitrogen | A11122 | |
| Rabbit anti-GnRH | Affinity Bio Reagent | PA1-121 | |
| Dylight488-donkey anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | SA5-10038 | |
| SA-Alexa Fluor 546 | Life Technologies | S-11225 | |
| Primers | |||
| BL Fwd (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | ATGAAGATGATGAGCACCAG GGC |
|
| BL Rev (for BIZ genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCCCTCGCCGCAGAACTC | |
| Cre Fwd (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCGATGCAACGAGTGATGAG GTTCG |
|
| Cre Rev (for Cre genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTAC ACCTGC |
|
| TTC Fwd (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT | |
| TTC Rev (for GTT genotyping) | Eurofins MWG Operon | GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCT TGAA |
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| XY Fwd (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | TGAAGCTTTTGGCTTTGA | |
| XY Rev (for gender genotyping) | Eurofins MWG Operon | CCGCTGCCAAATTCTTTG | |
| ROSA26 Fwd | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
| ROSA26 Rev | Eurofins MWG Operon | GCAGATGGAGCGGGAGAAAT | |
| SA Rev | Eurofins MWG Operon | CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC | |
References
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