Influensa viruspropagering i embryonerade hönsägg
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
Influensa infektion är associerad med ca 36.000 döda och mer än 200.000 sjukhus varje år i USA. Den kontinuerliga uppkomsten av nya influensavirus stammar på grund av mutation och åter sortiment komplicerar kontrollen av viruset och nödvändiggör den ständiga utvecklingen av nya läkemedel och vacciner. Den laboratoriebaserad studie av influensa krävs en pålitlig och kostnadseffektiv metod för förökning av viruset. Här är en omfattande protokoll som avses influensa A-virus förökning hos fertila hönsägg, som konsekvent ger hög titer virala lager. I korthet, är serum patogenfria (SPF) befruktade hönsägg inkuberades vid 37 ° C och 55 till 60% fuktighet under 10 till 11 dagar. Under denna period kan embryoutveckling lätt övervakas med hjälp av ett ägg Candler. Virus inokulering utförs genom injektion av virusförråd in i allantoiskaviteten hjälp av en nål. Efter två dagars inkubation vid 37 ° C, äggen ärkyld under minst 4 h vid 4 ° C. Den äggskal ovanför luftsäcken och korioallantoinmembranet därefter försiktigt öppnas och allantoisvätska innehållande viruset skördas. Fluiden rensas från skräp genom centrifugering, alikvoterades och överfördes till -80 ° C för långtidsförvaring. Den stora mängden (5-10 ml virusinnehållande vätska per ägg) och hög virus titer som vanligtvis uppnås med detta protokoll har gjort användningen av ägg för viruspreparat vårt gynnsamma metoden, i synnerhet för in vitro-studier som kräver stora mängder av virus i vilket behövs höga doser av samma virus lager.
Introduction
Influensa A fortsätter att vara ett stort hot mot människors hälsa. Det är en potentiellt förödande respiratorisk sjukdom med en stor global börda orsakar upp till 500.000 dödsfall årligen 1 i världen. Influensavirus är i familjen Orthomyxoviridae och bära åtta negativ-sense enkelsträngat RNA i sitt genom 1,2. Den höga föränderlighet (dvs antigena "avdrift") av det virala genomet förhindrar långvarig immunitet. Dessutom är influensa alltmer resistent mot antivirala läkemedel 3.
Den 2009 H1N1 influensapandemi markeras alla utmanande frågor i samband med influensasjukdom (pandemistammen, anti-virusresistens, fördröjd vaccinproduktion). Vaccinformuleringen bestäms årligen av Världshälsoorganisationen för de mest sannolika patogena influensastammar (en vardera för H1N1, H3N2 och influensa B) 4. Eftersom denna metod är baserad på förutsagd influensastams, är patogena stammar ibland felaktigt identifierade och vaccineffekt sjunker dramatiskt. Dessutom kan uppkomsten av stammar nya influensa kringgå dessa förebyggande program som orsakar pandemin sjukdom 2.
Skapandet av ett universellt influensavaccin har varit svårfångade 5. Därför måste forskningen fortsätter in förstå patogenesen av lungskada. Till anläggningen laboratorieforskning har flera metoder utvecklats för viral isolering och förökning 6. Mänskliga influensavirus kan amplifieras i en mängd av däggdjurscellsubstrat. Dock genererar hög titer virus i stora mängder bäst uppnås i embryo ägg. Följande protokoll beskriver en teknik för influensa A-virus förökning och lagring från befintliga virusstammar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Influensa orsakar en stor globala sjukdomsbördan, och arbetet fortsätter in förstå patogenesen av lungskada 7. Att underlättat forskningen i denna dödliga sjukdom, har olika metoder utvecklats för att propagera influensavirus 6. Här beskriver vi en teknik för att producera influensavirus i hönsägg. Fördelen med denna metod är att den är mycket reproducerbar och resulterar i stora mängder med hög titer influensavirus lager, vilket ofta är nödvändigt för studier in vitro.…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
