Грипп Вирус Распространение в куриные эмбрионы
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
Инфекция гриппа связана с примерно 36 000 смертей и более 200 000 случаев госпитализации каждый год в Соединенных Штатах. Непрерывное появление новых штаммов вируса гриппа из-за мутации и повторного ассортимента усложняет контроль над вирусом и требует постоянного развития новых лекарственных препаратов и вакцин. Лабораторная исследование гриппа требуется надежный и экономически эффективный способ распространения вируса. Здесь полный протокол, предусмотрена гриппа A распространения вируса в плодородных куриных яиц, которые последовательно дает высокий титр вирусных акций. Вкратце, свободных от патогенов (SPF) оплодотворенные куриные яйца сыворотки инкубировали при 37 ° С и влажности 55-60% в течение 10 – 11 дней. За этот период, развитие эмбриона можно легко контролировать с помощью яиц Candler. Вирус прививки проводят путем инъекции вируса в наличии аллантоидной с помощью иглы. После 2 дней инкубации при 37 ° С, яйцаохлажденные в течение по меньшей мере 4 ч при 4 ° С. Теплый выше мешка воздуха и хориоаллантоисной мембране затем осторожно открывали и аллантоисной жидкости, содержащей вирус собирают. Жидкость очищается от мусора с помощью центрифугирования, аликвоты и переносят в -80 ° С в течение длительного хранения. Большое количество (5-10 мл вируса, содержащих жидкости в яйце) и высокий титр вируса, который, как правило, достигнутые с этим протоколом составил использование яиц для приготовления вируса наш способ выгодно, в частности, для исследований в пробирке, которые требуют больших количествах вируса, в которых необходимы высокие дозы одного и того же вируса складе.
Introduction
Грипп продолжает оставаться серьезной угрозой для здоровья человека. Это потенциально разрушительными респираторное заболевание с большой глобальное бремя в результате чего до 500000 смертей в мире ежегодно 1. Вирусы гриппа в семье Orthomyxoviridae и нести 8 отрицательной смысле одноцепочечной РНК в их геноме 1,2. Высокая изменчивость (то есть, антигенная "дрейф") вирусного генома предотвращает длительный иммунитет. Кроме того, грипп является более устойчивым к антивирусным препаратам 3.
2009 пандемии гриппа H1N1 подчеркнул все сложные вопросы, связанные с болезнью гриппа (пандемического штамма, против вирусного сопротивления, отложенный вакцина). Вакцинный препарат определяется ежегодно Всемирной организацией здравоохранения для наиболее вероятно патогенных штаммов вируса гриппа (одной для H1N1, H3N2 и гриппа В) 4. Поскольку этот способ основан на предсказанной штамма вируса гриппас, патогенные штаммы иногда неправильно определены и эффективность вакцины резко падает. Кроме того, появление новых штаммов гриппа может обойти эти профилактические программы, вызывающие пандемию болезни 2.
Создание универсальной вакцины гриппа был неуловим 5. Таким образом, исследования должны продолжаться и в понимании патогенеза поражения легких. Для объекта лабораторных исследований, несколько методов были разработаны для выделения вируса и распространения 6. Вирусы гриппа человека могут быть усилены в различных млекопитающих клеточных субстратов. Тем не менее, генерирующие высокий титр вирусов в больших количествах лучше всего достигается в яйцах с эмбрионами. Следующий протокол описывает метод для гриппа A распространения вирусов и хранения из существующих запасов вируса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Грипп вызывает большое глобальное бремя болезней, и работа продолжается в понимании патогенеза поражения легких 7. Для облегченного исследований в этой смертельной болезни, различные методы были разработаны для распространения вируса гриппа 6. Здесь мы опишем технику для ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
