Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
La infección por influenza se asocia con alrededor de 36,000 muertes y más de 200,000 hospitalizaciones cada año en los Estados Unidos. La aparición continua de nuevas cepas de virus de la gripe debido a la mutación y re-surtido complica el control del virus y requiere el desarrollo permanente de nuevos fármacos y vacunas. El estudio de laboratorio de influenza requiere de un método fiable y rentable para la propagación del virus. Aquí, se proporciona un protocolo completo para la gripe A la propagación de virus en huevos de pollo fértiles, que produce consistentemente stocks virales de alto título. En resumen, (SPF) huevos de gallina fertilizados libres de patógenos de suero se incuban a 37 ° C y 55-60% de humedad durante 10 – 11 días. Durante este período, el desarrollo del embrión se puede controlar fácilmente con un candler huevo. La inoculación del virus se lleva a cabo mediante la inyección de stock de virus en la cavidad alantoidea usando una aguja. Después de 2 días de incubación a 37 ° C, los huevos sonrefrigerada durante al menos 4 horas a 4 ° C. La cáscara de huevo por encima de la bolsa de aire y la membrana corioalantoidea continuación, se abrió cuidadosamente, y el fluido alantoideo que contiene el virus se recoge. El líquido se elimina de los desechos por centrifugación, se dividió en alícuotas y se transfiere a -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. La gran cantidad (5-10 ml de virus que contiene fluido por huevo) y de alto título de virus que se consigue normalmente con este protocolo ha hecho que el uso de huevos para la preparación de virus nuestro método favorable, en particular para los estudios in vitro que requieren grandes cantidades de virus en los que se necesitan altas dosis de la misma stock de virus.
Introduction
La gripe A sigue siendo una amenaza importante para la salud humana. Es una enfermedad respiratoria potencialmente devastadora con una gran carga mundial que causa más de 500.000 muertes en el mundo cada año 1. Los virus de influenza son de la familia Orthomyxoviridae y llevan 8 de sentido negativo de ARN de cadena sencilla en su genoma 1,2. La alta mutabilidad (es decir, "deriva" antigénica) del genoma viral impide inmunidad a largo plazo. Por otra parte, la gripe es cada vez más resistente a los medicamentos antivirales 3.
La pandemia de gripe H1N1 2009 ponía de relieve todas las cuestiones difíciles asociados con la enfermedad de la gripe (cepa pandémica, la resistencia antiviral, la producción de vacunas retardada). La formulación de la vacuna es determinada anualmente por la Organización Mundial de la Salud para las cepas de gripe más probable patógenos (uno cada uno para H1N1, H3N2 y la influenza B) 4. Debido a que este método se basa en la cepa de gripe previstas, las cepas patógenas son ocasionalmente incorrectamente identificados y eficacia de la vacuna se reduce drásticamente. Por otra parte, la aparición de nuevas cepas puede eludir estos programas preventivos que causan enfermedad pandémica 2.
La creación de una vacuna contra la gripe universal ha sido difícil de alcanzar 5. Por lo tanto, la investigación debe continuar en la comprensión de la patogénesis de la lesión pulmonar. Para la investigación de laboratorio instalación, varios métodos se han desarrollado para el aislamiento viral y la propagación 6. Virus de influenza humana pueden ser amplificados en una variedad de substratos de células de mamíferos. Sin embargo, la generación de virus de alta titulación en grandes cantidades se logran mejor en huevos embrionados. El siguiente protocolo describe una técnica para la gripe A la propagación de virus y el almacenamiento de reservas de virus existentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La gripe causa una gran carga mundial de la enfermedad, y se sigue trabajando en la comprensión de la patogénesis de la lesión pulmonar 7. Para la investigación facilitado en esta enfermedad mortal, varios se han desarrollado métodos para propagar el virus de la gripe 6. Aquí se describe una técnica para producir virus de la gripe en huevos de gallina. La ventaja de este método es que es altamente reproducible y resulta en grandes cantidades de reservas de virus de la gripe de alta titulaci…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
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