Summary

En Utero Inyecciones intra-cardiaca-lectina de tomate en embriones de ratón para medir el flujo sanguíneo renal

Published: February 04, 2015
doi:

Summary

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Abstract

La formación y la perfusión de desarrollar vasos sanguíneos renales (aparte de los glomérulos) han sido poco estudiados en gran medida. Como vasculatura se desarrolla a través de la angiogénesis (la cual es la ramificación fuera de los grandes vasos) y vasculogénesis (de novo la formación de vasos), técnicas de mapeo de perfusión como moldes de resina, vivo de imágenes de ultrasonido en y micro-disección se han limitado en la demostración de las relaciones íntimas entre estos dos procesos y estructuras renales en desarrollo en el embrión. Aquí se describe el procedimiento de In Utero intra-cardíacos guiadas por ultrasonido marcados con FITC microinyecciones lectina de tomate en embriones de ratón para medir la ontogenia de la perfusión renal. Tomate lectina (TL) se perfundió todo el embrión y los riñones cosechado. Los tejidos fueron co-teñidos para diversas estructuras renales que incluyen: progenitores nefrona, estructuras nefrona, el epitelio uretral y la vasculatura. A partir de E13.5 vasos de gran calibre se perfundieron, sin embargo periféricavasos permanecieron no perfundido. Por E15.5 y E17.5, pequeños vasos periféricos, así como glomérulos comenzado a ser perfundido. Esta técnica experimental es fundamental para estudiar el papel de la vasculatura y el flujo sanguíneo durante el desarrollo embrionario.

Introduction

Durante el desarrollo embrionario dos procesos discretos, pero simultáneas, vasculares tienen lugar: la angiogénesis, el proceso por el cual un recipiente crece de un vaso principal, y la vasculogénesis pre-existente, que es una formación de novo de los vasos a partir de progenitores endoteliales residenciales 1,2. Respectivamente, el primero es sinónimo de flujo de sangre, mientras que el último se cree que tener lugar en gran medida en ausencia de la misma.

Simultáneamente a la formación de vasos sanguíneos, un proceso cíclico y dinámico de la síntesis renal de células progenitoras, la proliferación y la diferenciación comienza a desarrollarse en el día embrionario 9,5 (E9.5). En este punto la yema ureteral (UB) invade dorsal en los alrededores mesénquima metanéfrico (MM), y continúa hasta el nacimiento 3. Repetida de ramificación de la UB en condensación rápidamente mesénquima metanéfrico tapa comienza la formación de las unidades funcionales del riñón, la nefrona. Con cada nueva generación de la UB y nephron, las generaciones mayores son desplazados en regiones corticales y medulares interiores, donde luego se someten a más de maduración y diferenciación dentro de los entornos principalmente vascular-densos. Como se desprende de Dressler et al., 3, este proceso embriológico se precipita por la señalización inductiva, como diafonía entre UB y MM, y una miríada de factores extracelulares 3-6. Dos factores extracelulares recientemente investigados dentro del páncreas y los riñones incluyen el desarrollo de la tensión de oxígeno y el flujo sanguíneo 7,8. Este último será discutido en más detalle a continuación en relación con el desarrollo del riñón.

Con el fin de exponer el papel inductivo que el flujo sanguíneo potencialmente juega en la diferenciación de células progenitoras nefrona, así como en otros procesos de organogénesis, métodos precisos y exactos de mapeo de flujo de sangre embrionaria es imprescindible.

Los métodos alternativos para medir el flujo sanguíneo incluyen la prescripción de ultrasound de imágenes y resina yesos 9,10. En conclusión, estos modos se ha demostrado que ser inherentemente carente de su capacidad para dar a conocer simultáneamente yuxtaposiciones temporales y espaciales entre el flujo sanguíneo y diferenciación de células madre. Moldes de resina, por ejemplo, proporcionan un modelo válido de patrón embarcación dentro de los tejidos adultos, sin embargo en los vasos inmaduros, como con los puntos de tiempo embrionarias, los vasos son muy poco desarrollado y con goteras. Por lo tanto, la resina arroja fallar para mantener dentro de los vasos pequeños, a menudo porosa.

Por estas aparentes obstáculos, entre otros, se optó por incorporar guiada por ultrasonido vivo intra-cardíacos lectina de tomate embrionario (TL) en microinyecciones en nuestras investigaciones sobre el desarrollo del riñón. En este procedimiento utilizamos una sonda de ultrasonido para guiar sincrónicamente una aguja montada micropipeta llena con 2,5 l de solución de TL en el ventrículo izquierdo de embriones de ratón en los puntos de E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 y de tiempo. E170.5 es la última edad de desarrollo como las agujas no son lo suficientemente fuertes como para penetrar en el embrión más desarrollado.

Las ventajas de este método de microinyección son abundantes. Microinyección guiada por ultrasonido permite la colocación precisa de una aguja de inyección dentro del ventrículo izquierdo embrionario, la expulsión pasiva y controlada de solución en el corazón de la animal, un daño mínimo al corazón y los tejidos circundantes, y la evitación de la insuficiencia cardiaca súbita y la muerte de la embrión antes de la perfusión de todo el cuerpo. Con el uso de un TL marcado con FITC, cualquier vasculatura perfundido mantendrá el marcador a lo largo de su membrana apical endotelial. En combinación con la inmunohistoquímica, utilizando Pecam (CD31, plaquetas molécula de adhesión celular endotelial) y varios otros marcadores vasculares, somos capaces de distinguir claramente entre los vasos perfundidos y un-perfundido, así como caracterizar cualquier tinción aberrante de los tejidos circundantes.

Protocol

NOTA: La Universidad de Pittsburgh Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión aprobó todos los experimentos. 1. Elaboración de Instrumentos Ultrasonido-microinyección y embriones Establecer el escenario, montaje, y la sonda (Figura 1), así como los instrumentos quirúrgicos (Figura 2). Solución salina tamponada (PBS) Place solución de fosfato (pH 7,4) en un baño a 37 ° C el calentamiento. Llenar aguja de microinyección completamente con aceite mi…

Representative Results

Formación Vascular precede flujo en el desarrollo del riñón Una mayoría de tejido embrionario (incluyendo el riñón) contiene una vasculatura densa (ambos no perfundido y perfundidos), incluso en los primeros puntos de tiempo embrionarias. Para un mejor calibre y analizar el flujo de sangre dentro del riñón en desarrollo se utilizó un método de In Utero microinyecciones intracardiaco embrionarias. Con el uso de un ultrasonido de alta resolución para identificar el corazón embriona…

Discussion

Anestesia Microinyección y marco de tiempo

Con respecto a la anestesia de la madre, es esencial para mantener constante el flujo de aire (2-3 L / min) y a baja PSI. El flujo del sedante debe mantenerse a aproximadamente 1,75 a 2 L / min. Al mismo tiempo, los plazos en que las inyecciones se realizan deben ser monitoreados y controlados para con cada camada de cerca. Para cada camada el procedimiento de inyección debe mantenerse en 45 min. La importancia de este límite de tiempo es de suma…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children’s Hospital of Pittsburgh.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DAPI Sigma Aldrich 022M4004V concentration 1:5000
Pecam BD Biosciences 553370 concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin Vector Laboratories FL-1321 concentration 2.5µL / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat ) Jackson Immunoresearch 712-585-150 concentration 1:200
Microinjection Needle Origio Mid Atlantic Devices C060609
Mineral Oil Fisher Scientific BP26291
mL syringe Fisher Scientific 03-377-20
 Clay Blocks Fisher Scientific HR4-326
Surgical Tape Fisher Scientific 18-999-380
PBS Fisher Scientific NC9763655
Hair Removal Product Fisher Scientific NC0132811
Surgical Scissors Fine Science tools 14084-08
Fine Forceps Fine Science tools 11064-07
 Surgical Marking Pen Fine Science tools 18000-30
 Right angle forceps (for hysterectomy) Fine Science tools 11151-10

References

  1. Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
  2. Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8 (6), e65993 (2013).
  3. Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
  4. Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).
  5. Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).
  6. Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).
  7. Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
  8. Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).
  9. Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).
  10. Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).

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Citer Cet Article
Rymer, C. C., Sims-Lucas, S. In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow. J. Vis. Exp. (96), e52398, doi:10.3791/52398 (2015).

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