Summary

Metodi per valutare citotossicità e immunosoppressione di combustibile di tabacco preparati prodotti

Published: January 10, 2015
doi:

Summary

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

Abstract

Tra le altre modifiche fisiopatologiche, l'esposizione cronica al fumo di sigaretta provoca l'infiammazione e la soppressione immunitaria, che sono stati collegati a una maggiore suscettibilità dei fumatori a infezioni microbiche e di tumori. Ex vivo soppressione delle risposte immunitarie recettoriali nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) trattato con componenti del fumo è un approccio interessante per studiare i meccanismi e valutare i probabili effetti a lungo termine dell'esposizione ai prodotti del tabacco. Qui, abbiamo ottimizzato metodi per eseguire test ex vivo utilizzando PBMC stimolate da lipopolisaccaride batterico, una Toll-like receptor-4 ligando. Gli effetti di tutto a medio-fumo condizionata (WS-CM), una preparazione prodotto del tabacco combustibili (TPP), e la nicotina sono stati esaminati sulla secrezione di citochine e obiettivo l'uccisione delle cellule dai PBMC nelle ex vivo saggi. Abbiamo dimostrato che le citochine secrete IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 e IL-8 e citochine intracellulari IFN-47 ;, TNF-α, e MIP-1α sono stati soppressi in PBMC WS-CM-esposte. La funzione citolitica di PBMC effettrici, come determinato da un saggio di cellula bersaglio K562 uccidere è stato ridotto da esposizione a WS-CM; nicotina era minimamente efficace in questi test. In sintesi, vi presentiamo una serie di migliori test per valutare gli effetti delle centrali termiche nel ex vivo saggi, e questi metodi potrebbero essere facilmente adattato per testare gli altri prodotti di interesse.

Introduction

Un numero consistente di punti di conoscenza per gli effetti negativi per la salute del fumo di sigaretta cronica, tra cui malattie cardiovascolari (CVD), broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e il cancro 1,2. Il fumo di sigaretta cronica è stato conosciuto per causare infiammazione e la soppressione immunitaria, e queste alterazioni sono segnalati per contribuire ad un aumento del rischio di infezioni microbiche e cancro nei fumatori 3. In vitro e ex vivo le tecniche sono utili a chiarire le basi molecolari degli effetti fisiopatologici di fumo di sigaretta 4-9 (Tabella 1) e sono riconosciuti come importanti strumenti per guidare la regolamentazione emergente di vari prodotti del tabacco 10,11.

Ad esempio, abbiamo dimostrato che sostanze infiammabili prodotti del tabacco (centrali termiche) come complesso medio-fumo condizionata (WS-CM) e particolato totale (TPM) sono di gran lunga più citotossici e dannoso perDNA di centrali termiche non combustibili o nicotina 12,13. Coerentemente con il lavoro pubblicato, è stato recentemente riportato che le centrali termiche combustibili o nicotina 12,13. Coerentemente con il lavoro pubblicato, abbiamo recentemente riportato che centrali termiche combustibili causato marcata immunosoppressione. Ciò è stato dimostrato dalla soppressione del numero verde come recettore (TLR) -ligands, stimolata la secrezione di citochine, e mirata delle cellule (K562) l'uccisione da PBMC in un modello ex vivo 14. Data l'importanza di infiammazione in processi di malattia fumo-indotta sigaretta, un'ulteriore ottimizzazione delle condizioni di analisi per valutare gli effetti modulatori immunitari del fumo di sigaretta è presentata in questo rapporto.

Gli ex vivo saggi tipicamente misurate intracellulare e citochine, nonché la funzione citolitica di T citotossici e le cellule NK nella cella K562 uccidendo 14 saggi secreti. I saggi coinvolti pre-incubazione con WS-CM e nicotina e successiva stimolazione di PBMCs con TLR agonisti per un periodo di 3 giorni; le letture finali sono eseguite utilizzando saggi immunoenzimatica (ELISA) e / o di citometria a flusso. Abbiamo utilizzato lipopolisaccaride batterico (LPS), che si lega a recettori TLR-4 e stimola PBMC conseguente produzione di citochine intracellulari e secrezione di citochine. Oltre all'ottimizzazione dei vari passaggi del test per valutare gli effetti immunomodulatori di centrali termiche, abbiamo anche i metodi attuali per PBMCs isolamento, saggi di morte cellulare, e IL-8 quantificazione. Questi metodi possono essere applicati per affrontare altre questioni di ricerca e ulteriormente raffinato per valutare i prodotti del tabacco nel contesto normativo.

Tabella 1. Pubblicato segnalazioni di in vitro e ex vivo i metodi utilizzati per studiare varilus effetti fisiopatologici di preparati prodotti tabacco CS, media fumo di sigaretta.; CSC, fumo di sigaretta condensa; CSE, estratto di fumo di sigaretta; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; GADPH, gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi; qPCR, reazione a catena della polimerasi quantitativa; RT, in tempo reale reazione a catena della polimerasi quantitativa; TS, fumo di tabacco.

Autore (Anno di corso) Laan et al. (2004) Moodie et al. (2004) Oltmanns et al. (2005) Vayssier (1998) Witherden et al. (2004) Birrell et al. (2008)
Le cellule utilizzate Le cellule umane bronchiali endoteliali (BEAS-2B), neutrofili umani Cellule epiteliali alveolari umani (A549) Vie aeree liscio cellule muscolari umane (HASMC) U937 premonocytic umane, monociti umani Tipo alveolare II cellule epiteliali (ATII) Monocitica umanalinea cellulare (THP-1), macrofagi polmonari umane
TPP usato CSE CSC CSE TS CSE CS
Metodo utilizzato ELISA, qPCR, immigrazione, spostamento elettromobilità Immunoistochimica-chimica, elettroforesi, kit Arrayscan, RT-PCR, ELISA ELISA, RT-PCR, qPCR, elettroforesi Spostamento Gel-mobility La microscopia ottica, microscopia elettronica, elettroforesi, ELISA qPCR, ELISA, kit E-toxate (Sigma), piastra di p65 dosaggio (Transam), elettroforesi, vari kit immunodosaggio
Misura IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migrazione Acetiltransferasi istoni, istone deacetilasi, NF-kB, IL-8, pI kB-α, GADPH HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotassina Calore scossa / di stress proteine ​​(HSP / Hsp70), HF fattore di trascrizione NF-kB,TNF-α Tensioattivo proteina (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, α-TNF, IL-1β, IFN-γ IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK fosforilazione, cJun: legame al DNA, il glutatione, p65: legame al DNA
Risultato finale CSE down-regola la produzione di citochine mediante la soppressione di AP-1 attivazione. H 2 O 2 e CSC migliorare acetilazione delle proteine ​​istoniche, diminuire l'attività dell'istone deacetilasi, differenziale regolano il rilascio di citochine proinfiammatorie. Il fumo di sigaretta può causare il rilascio di IL-8 da HASMC, arricchito da TNF-α, il 20% CSE meno di IL-8 rilascio, inibizione di eotassina e RANTES dal fumo di sigaretta. TS attivati ​​fattore HF di trascrizione, che è stato associato con Hsp70 sovraespressione e l'inibizione di NFkB attività e di rilascio del TNF-α vincolante. Ridotto ATII livelli chemochine derivati ​​dalle cellule compromesso alveoriparazione lar, contribuendo al fumo di sigaretta indotto danno alveolare e l'enfisema. I dati forniscono spiegazione meccanicistica del perché i fumatori sono aumentate le infezioni respiratorie. Soppressione della risposta innata è accompagnata da un aumento di IL-8.

Protocol

NOTA: consenso informato scritto per fare questo studio è stato ottenuto in una unità di ricerca clinica locale in corso di approvazione IRB, per Good Clinical Practices. Lavorazione di sangue, l'isolamento delle PBMC e altri esperimenti di coltura cellulare sono eseguite in condizioni sterili, utilizzando forniture microbiologicamente sterili e reagenti. 1. WS-CM Preparazione Generare WS-CM 12 come precedentemente descritto. Preparare WS-CM passando fumo…

Representative Results

I risultati sono stati presentati come media ± errore standard della media (quattro campioni dei donatori). T-test di Student tra i campioni trattati e di controllo non trattati è stata effettuata utilizzando il software Excel nonché comparazioni t-test per tutti i trattamenti ai rispettivi controlli corrispondenti. La significatività statistica è stata indicata da: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005. Per misurare l'effetto dell'esposizione alla WS-CM e nicotina, …

Discussion

Noi e altri abbiamo già dimostrato che il trattamento dei PBMC con centrali termiche sopprime diverse risposte, tra cui l'espressione e la secrezione di citochine e misure funzionali come cellula bersaglio uccidendo 14. I metodi sperimentali descritti nel precedente lavoro richiedono periodi di incubazione più lunghi e sono stati modesti in grandezza 14. Date le potenziali applicazioni di questa affascinante ex vivo modello di ricerca di base e applicata, abbiamo studiato se nessuno …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è finanziato da RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) nell'ambito di un accordo di ricerca in collaborazione con la Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad è un dipendente a tempo pieno di RJRT.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
12 X 75 tubes BD Falcon 352058
15 ml conical tubes Corning 430790
2 mL Microtubes Axygen MCT-150-C-S
3R4F reference cigarettes   Univ. of Kentucky, College of Agriculture 3R4F
50 ml conical tubes Corning 430828
500 ml bottle Corning 430282
7AAD BD Pharmingen 559925
96 well flat bottom plate Termo Nunc 439454
96 well round bottom plates BD Falcon 353077
Cell culture hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Centrifuge Eppendorf 58110R
CFSE Molecular Probes Life Technologies C34554
Cluster tubes Corning 4401 Harmful if swallowed, carcinogen
Cytofix/Cytoperm (Permwash) BD Biosciences 555028 Flammable
DMSO (Dimethyl sulfoxide ) Sigma-Aldrich D8418
DPBS Lonza 17-512F
FBS Sigma-Aldrich F2442
FCAP Array BD Biosciences 652099 Software analyzes CBA data
Filter unit Nalgene 156-4020
Flow Cytometer BD Biosciences FACS Canto II  8 colors, at Ex 405 and Em785.
Flow Cytometer BD Biosciences FACS Calibur  4 colors at Ex 495 and Em 785.
Flow cytometry analysis software Tree Star FlowJo
Freezing Container Nalgene 5100-0001 Contains DMSO,  irritant
GogliPlug BD Biosciences 555029 Carcinogen, Irritant, Corrosive 
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741
Human Inflammatory Cytokine Kit BD Biosciences 551811
IFN-γ V-500 Antibody BD Horizon 561980  skin sensitizer
IL-8 ELISA Kit R and D Systems DY208
Isolation Buffer Isolymph, CTL Scientific Corp. 1114868 Flammable liquid, Irritant 
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907
L-Glutamine Gibco Life Technologies 25030-081
LPS Sigma-Aldrich L2630
MIP1-α PE Antibody BD Pharmingen 554730 Acute toxicity, Oral
Monensin Sigma-Aldrich M5273
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Nicotine Sigma-Aldrich N3876 Acute toxicity, Environmental hazard
Parafilm Bemis “M”
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Flammable, Skin irritation 
Pen/strep Gibco Life Technologies 15140-122
RPMI 1640 Gibco Life Technologies 11875-093
Running buffer MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech 130-091-221
Th1/Th2 CBA Kit BD Biosciences 551809
TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody BioLegend 502915
Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-20
Tris Base Sigma-Aldrich T1503

References

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Citer Cet Article
Arimilli, S., Damratoski, B. E., G.L., P. Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations. J. Vis. Exp. (95), e52351, doi:10.3791/52351 (2015).

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