화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포
Summary
프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 및 사체 연구에 기초하여 두 개의 시험관 발생 독성 시험 시스템 (UKK 및 UKN1)를 설명한다. 테스트 시스템은 인간 발생 독성 위험을 예측하고, 동물 연구, 비용 및 화학 물질의 안전성 검사에 필요한 시간을 단축에 기여할 수있다.
Abstract
-omics 기술이 잠재적 인 약물의 체외 독성 시험에 대한 새로운 지평을 열어 효율적인 프로토콜은 조합의 다양한 조직으로 인간 만능 줄기 세포를 구별한다. 이러한 분석 용 고체 과학적 근거를 제공하기 위해서는, 현상시 코스 및 시스템 생물학 방법에 의해, 기본 규제 메커니즘 정량적 정보를 얻기 위해 중요하다. 두 분석 따라서 이러한 요구 사항 여기를 조정하고있다. UKK 테스트 시스템에있어서, 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) (또는 다른 다 능성 세포) 자발적 세 배엽 세포의 생성을 허용하도록, 배아 체에서 14 일 동안 분화하도록 남겨진다. 이 시스템은 초기 인간 배아 발달의 주요 단계를 되풀이되었습니다, 세포가 분화하는 동안 화학 물질에 노출 될 경우는, 인간 고유의 초기 배아 독성 / 기형을 예측할 수있다. UKN1 테스트 시스템의 populat에 hESC의 미분에 기초신경 외배엽 전구 이온 (NEP) 육일에 대한 세포. 이 시스템은 초기 신경 발달을 되풀이되었습니다 초기 발달 신경 독성 및 화학 물질에 의해 유발 후생 유전 학적 변화를 예측한다. 두 시스템은, 전 사체 마이크로 어레이 연구와 함께, 생체 독성을 확인하기에 적합하다. 또한, 이들은 시스템 생물학 분석 입력 데이터를 생성하도록 조합하여 사용될 수있다. 이 테스트 시스템은 동물의 대용량을 필요로하는 기존의 독성 연구에 비해 많은 장점을 갖는다. 테스트 시스템은 약물 개발 및 화학적 안전성 평가를위한 비용의 절감에 기여할 수있다. 이들의 조합은 특히 특별히 신경 발달에 영향을 미칠 수있는 화합물에 빛을 비춰.
Introduction
다양한 유형의 세포로 분화하는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)의 능력은 시험 관내 독성 시험 한 질병 모델링 및 재생 의학 (2)의 새로운 시대를 열었다. 줄기 세포는 자기 복제 할 수있는 능력, 자신의 만능 상태를 유지하고, 전문 세포 3,4로 분화에 부여된다. hESC의의 특성 또한 유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSC) 또는 핵 이식 (5)에 의해 생성 된 세포와 같은 다른 사람 다 능성 줄기 세포에서 발견되는 (용량은 모든 주요 세포 타입을 구별하기 위해). 예를 들어, 많은 다른 hESC의 라인은 세포 (13, 14)과 같은 신경 (6), 신장 세포 (7), 신경 능선 세포 (8), 심근 9-12, 또는 간세포로 분화되었다. 또한, hESC의 자발적 배아 체 (사채) (19, 20)의 세 가지 배엽 15 ~ 18의 세포로 분화 할 수 있습니다. 전자아 흘리 배아 개발은 마이크로 어레이 기술 (15)를 사용하여 transcriptomics하여 mRNA의 수준에서 포착 된 다른 배엽과 관련된 다양한 유전자의 발현에 의해 조절된다. 이러한 노력은 hESC의 / hiPSC 및 transcriptomics 분석 (검토를 위해 21, 22 참조)를 기반으로 장기 특정 독성 모델의 설립 귀착되었다. 이러한 모델은 실험 동물은 항상 인간의 안전을 예측하지 않습니다 사용하여 전임상 연구 등의 독성 연구를위한 실험 동물의 전통적인 사용에 장점을 가지고있다. 환자에서 발생하는 약물에 의한 부작용은 종종 인간과 실험 동물 사이에 차이가 신진 대사 또는 신호 처리와 관련이 있습니다. 종의 차이는 인간에서 발생 독성의 안정적인 조기 발견을 방지하고 있으며, 이러한 탈리도마이드 (23, 24) 및 디 에틸 25, 26 등의 인스턴스 의약품으로 인한 기형으로 시장에서 철수했다. Thalidomide 쥐 또는 마우스의 모든 발생 독성을 표시하지 않았습니다. 메틸 수은 (27) 등의 환경 화학 물질은 다양한 종류의 신경계에 대한 태아 발생 독성에 나 섰으나 인간의 표현은 동물 모델 어려운되었습니다. 종 특이성 문제의 문제를 해결하기 위해, 다른 프로젝트에서 일하는 과학자 등으로 의심되는 인간의 독성 물질을 사용하여 배아 독성, 신경 독성, 심독성, 간독성 및 신 독성에 대해 서로 다른 모델의 개발에 종사하는 ReProTect, ESNATS 형사 같은 줄기 세포를 기반으로 인간에 영향을 미친다. 유럽 컨소시엄 프로젝트 '배아 줄기 세포 기반 소설 대체 시험 전략 (ESNATS)'에서 다섯 테스트 시스템이 설정되어있는 것. 하나의 테스트 시스템 소위 UKK (U niversitäts K linikum K OLN) 테스트 시스템은 부분적 초기 인간 배아 발달을 캡처한다. 이 S에서템 인간 배아 H9 세포는 세 배엽 (외배엽, 내배엽과 중배엽) 15 배엽 특정 서명 어피 메트릭스 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여 프로파일 transcriptomics에 의해 포착 된 것으로 차별화된다. 탈리도마이드 (28), 발 프로 산, 메틸 수은 16,17 또는 시토신 아라 비노 시드 (15)과 같은 다양한 발달 독성 물질이 시스템에서 테스트되었고, 독성 특정 유전자 서명은 얻어졌다. 제 2 테스트 시스템에서, 테스트 시스템이므로 1 UKN1 (K onsta N Z의 U의 niversity)라고 H9 세포를 6 일 동안 신경 외배엽 전구 세포 (NEP)로 분화된다. 이는 같은 PAX6와의 Otx2 같은 신경 유전자 마커의 높은 발현에 의해 입증된다. 분화 동안 육일을 위해, NEP 세포는 이러한 VPA, 메틸 수은과 같은 발달 신경 독성 물질에 노출되어있다. 독성 물질 별 탈 규제 transcriptomics 프로필 obtai되었습니다어피 메트릭스 마이크로 어레이 플랫폼 16,29를 사용하여뿐만 아니라 네드.
21 세기의 독성에 대한 새로운 비전은 테스트 시스템은 장기 독성 물질의 배양의 끝에 생체 내에서 조직 병리학, 또는 사체 변경과 같은 표현형 설명을 생성 할뿐만 아니라 것을 상상한다. 오히려 분석법 기계론 3 정보를 제공하고 있음이 정보는 소위에 매핑 될 수 있다는 것을 시사 불리한 결과 경로 (AOP) 유해 효과 (30)에 대한 과학적 근거를 제공 할 것이다. 그러한 정보를 제공하기 위해 적용된 테스트 시스템은 높은 품질의 강력한 표준 작업 절차 문서화 인스턴스로서, 31으로 제어되어야한다. 또한, 시간에 따른 변화는 높은 해상도로 매핑 할 필요가있다. 이 동기화 변경 32 테스트 시스템을 필요로한다. 여기에 설명 된 UKN1 및 UKK 테스트 시스템은 이러한 요구 사항에 최적화되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
독성 시험에 대한 전통적인 접근법에 따라서 테스트 비용과 시간이 많이 소요하게 광범위한 동물 연구를 포함한다. 또한, 종간의 차이로 인해 전임상 동물 안전 연구는 인간을위한 관련 잠재적 인 약물의 독성 효과를 예측하는 항상 유효하지 않습니다. 인간이 아닌 영장류, 가장 예측, 여전히 윤리적 강하고 socioeconomical 요구는 빠르게 체외 시험에 민감하고 강력한 개발하는 현대 사회에 의…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani and Cornelia Böttinger for excellent technical support. This work was supported by grants from the German Research Foundation (RTG 1331) and the German Ministry for Research (BMBF).
Materials
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| Vbottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin- Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio- sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 | |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| List of equipment. | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven – 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
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