Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.
Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.
Inflammatorisk reaksjon på sykdom eller skade i sentralnervesystemet (CNS) er dårlig forstått, spesielt med hensyn til samspillet mellom immun og bosatt celler i vev. Undersøkelser av disse cellulære interaksjonene i ryggmargen er av særlig interesse i levende dyr. Den eneste lett tilgjengelige CNS hvit substans kanalen er i dorsal kolonner med ryggmargen, noe som gjør dette til et viktig område som å fokusere innsatsen på å forbedre mulig eksperimentell tilnærming. Disse undersøkelsene har vært begrenset på grunn av tekniske problemer med å få tilgang og stabilisere CNS for bildebehandling. Live-avbildning i ryggmargen har blitt beskrevet tidligere 1-13, men få studier har adressert cellulær bevegelse i en ryggmargsskade utover noen få timer etter den første fornærmelse. Den traumatiske ryggmargs lesjon er et komplekst miljø, med nevroner, astrocytter, fibroblaster, NG2 stamceller, og immunceller including microglia, nøytrofiler, makrofager, T-celler, B-celler og dendrittiske celler 14,15. Makrofager er den delen av immunceller som er ansvarlige for fagocytose i lesjonen, infiltrere fra sirkulasjonen. Rollen til disse fagocyttceller har vært diskutert, med rapporter som indikerer at disse cellene kan ta på både skadelige og beskyttende roller i det skadde vevet. Disse rollene varierer fra økt sekundær aksonal dieback etter en skade og handle på en phagocytic måte 16-22, til å ta på seg en sårheling fenotype og minkende funksjonelle underskudd i den skadde dyr 21,23,24.
Tidligere forsøk på å skille makrofager fra mikroglia har stolt primært på morfologi i friskt vev. Imidlertid aktiverte mikroglia og makrofager uttrykker mange av de samme markører og vise utvisket morfologi etter skade 25-29, noe som gjør separeringen av forskjellige aktivitetene til disse cellene vanskelige å studere based på disse faktorene alene 30. Disse cellene kan bli separert ved differensiell ekspresjon av CD45 ved hjelp av strømningscytometri 33,34, selv om denne fremgangsmåte er mindre nyttig for å diskriminere disse celletyper in vivo. Utnytte differensial uttrykk for CCR2 og CX3CR1 i mikroglia og makrofager har også blitt utforsket, selv om de dynamiske endringer i uttrykket av disse markørene som monocytter differensieres til makrofager kan komplisere nøyaktig analyse 35,36. Mikroglia er bosatt immunceller i CNS og oppstå fra plommesekkstamfedre under fosterutviklingen, mens makrofager er utledet fra beinmargsstamfedre og skriv den skadde CNS etter en fornærmelse 31,32. En alternativ tilnærming til bruk morfologi for å skille disse to celletyper er å erstatte benmargen med progenitorer fra en donor dyr som uttrykker et spor markør i makrofagene som stammer fra donor forløpere, og samtidig bevare CNS resident, reciptorer-avledet mikroglia. Disse benmarg kimære modeller er vanligvis benyttes i mange andre anvendelser 37-40. Denne metoden har unike begrensninger assosiert med skade på integriteten av blod-hjernebarrieren forårsaket av bestråling eller cytotoksiske medikamenter som brukes til å utrydde marg progenitorceller i verten, for derved å begrense dens bruk i visse anvendelser. Nylig er funksjonelle forskjeller mellom mikroglia og makrofager i CNS begynner å skjelnes ved hjelp av flowcytometri, genet chip rekke analyse og kimerisme metoder 24,26,41-44, som vil være svært nyttig i fremtiden. Selv skille disse to celletyper er fortsatt vanskelig, forstå deres unike funksjoner er viktig i fører til mer målrettede behandlinger av lidelser som involverer både mikroglia og makrofager innen CNS.
Beskrivelse av cellulære interaksjoner i ryggmargen lesjon har først og fremst kommet fra studier med cellekultur modeller. Dette er due til utfordringene med bildebehandling både ryggmargen lesjon og immunceller sammen i et levende dyr. Nåværende gnager modeller av ryggmargsskade av varierende type og alvorlighetsgrad inkluderer kontusjon modeller 45,46, Nålestikk skader 2, sårskader 47 og rygg kolonne knusningsskade beskrevet her 16,18,48. Betennelse i hjernehinnene øker med alvorlighetsgraden av skaden og gir unike utfordringer for implantasjon av vinduer eller operasjoner for serie bildebehandling. Noen av disse utfordringene inkluderer infiltrasjon av fagocytiske celler, så vel som dannelse av fibrøst vev over operasjonsstedet. Noen av disse problemene kan overvinnes ved å skape mindre lesjoner og dekker den eksponerte ryggmargen med ikke-immunogenisk kirurgisk dressing mellom dura og paraspinous muskler for å tillate påfølgende gjenåpning kirurgi, slik det gjøres her for å studere rygg kolonne klemskade . Evnen til bildet bare ryggdelen av spinnal ledningen begrenser også valg av skade, siden kontusjon modeller primært forårsake skader på sentral snor, ofte sparsom den mest dorsal del av ryggsøyler, spesielt på tidlig tidspunkt etter skade 45,49. Derfor beskriver vi en enkel skade modell som gir et rent, repeterbar, rektangulær formet lesjon som er nyttig både for observasjon av celle bevegelse i lesjonen, og for enkel kvantifisering av aksonal stilling i forhold til lesjonen.
Imaging interaksjoner av ulike celletyper i sitt eget vev avdelinger under påfølgende patologi i sanntid har vakt stor interesse. Innen tett nettverk av CNS, celle-celle kontakt og signalering med tilstøtende celler er viktig for normal funksjon og for å forstå CNS patologi. Her har vi beskrevet anvendelse av 2-foton laser scanning mikroskop for observasjon av cellulær bevegelse i en mekanisk skade i ryggmargen. I tillegg til kvaliteten på operasjonen og vevspreparat, er mekanisk stabilitet av vev av vesentlig betydning for vellykket time-lapse mikroskopi, spesielt isolasjon av ryggmargen fra pustebevegelsesartefakter. Stabilitet kan bli vurdert ved å se på bevegelsen av ryggmargen under et disseksjonsmikroskop som svarer til den puls eller puste av dyret. Stabilitet bør vurderes både mens du utfører operasjonen og også umiddelbart før du begynner bildebehandling. Hvis animal er ikke stabil, justeringer bør gjøres til plassering og tetthet av ryggmargs klemmer. Celle-type spesifikke fluorescerende reporter musemodeller kombinert med benmargs chimera tilnærminger har tillatt identifisering av monocyttiske celler versus mikroglia og aksoner. Tidligere studier har vist at blod avledet monocytter og ikke mikroglia har ansvar for videregående aksonal skade etter traumer ved hjelp av metoden beskrevet her 43. Dekstran konjugert fartøy fargestoff tillater skipsidentifikasjon både å gi landemerker og å identifisere brudd i fartøyets integritet. Valget av den passende fluorescerende reporter musemodell er kritisk for å tillate identifikasjon av de ønskede celletyper som skal avbildes.
Utvikling av fluorescerende musemodeller som er aktuelle for de studiene som blir gjennomført er også avgjørende for å lykkes med eksperimenter. Skille mellom de to fagocytiske populasjoner av CX3CR1 + / GFP </sup> Celler i CNS har tradisjonelt vært vanskelig. Som vist her, kan et felles immunologisk teknikk, bestrålings kimærer, bli anvendt for å skille radioresistente, CNS-resident mikroglia fra benmarg-avledede makrofager. Bestrålingsprosedyren har potensial til å ødelegge blodhjernebarrieren og endrer celle fenotyper, slik at bruk av denne modellen må vurderes nøye. Omfanget av disse endringene er forskjellig med bestråling dose samt varighet av restitusjonsperioden, og deres innvirkning på ulike inflammatoriske modeller har ikke blitt fullt ut undersøkt. Virkningene av bestråling på CNS blod-hjerne-barrieren kan bli minimalisert ved å skjerme hodet under bestråling, og dette har vist seg å redusere celleinfiltrasjon inn i ryggmargen etter bestråling, selv om ryggraden ikke er direkte skjermet 52. Her har vi observert at antallet celler infiltrere inn i CNS ved stabil tilstand som et resultat av kimær generasjon er ubetydelig i motsetning til nummeneh av celler som kommer inn i lesjonen. Andre alternative modeller for å vurdere inkludere narkotikainduserte chimeras 52 eller parabiotic musemodeller 53.
Her har vi presentert et konkret, enkel og reproduserbar liten skade modell som resulterer i en lesjon til rygg hvit substans i ryggmargen som er lett å bilde ved hjelp av to-foton mikroskopi. Denne metoden gir også en kvantifiserbar lesjon å analysere graden av aksonal dieback i ryggsøyler som i litteraturen har blitt kombinert med utfyllende fast vev analyse 16,18,43,48,54. I denne modellen, dyr viser bare minimale underskudd og krever ingen spesiell behandling etter skade. Fremtidige studier med dorsal kolonne knuse skade- og imaging teknikker som er beskrevet her kan være kraftige screening verktøy for å vurdere effekten av behandling for ryggmargsskade. Disse behandlingene kan inkludere små molekyl hemmere, narkotika, celleprodukter, vev grafts og kombinatorisk behandlings. Samspillet mellom makrofager, mikroglia og neuroner er også sannsynlig å spille en rolle i andre sykdomsmodeller i ryggmargen, inkludert multippel sklerose, tumor, meningitt og amyotrofisk lateral sklerose, og denne teknikk kan være nyttig ved undersøkelsen av disse sykdommer, så vel .
The authors have nothing to disclose.
The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
60mm2 petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
Falcon 40 um cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
1x15mL and 1x50mL conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
16 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
1ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
HBSS | Gibco | 1E+07 | For bone marrow isolation |
RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
30-gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9E+06 | For imaging |
4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
Reflex Clips, 7mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
Marcaine | Henry Schein | 6E+06 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mm NaCl | For surgery |
26.2 mM NaHCO3 | From Cold Spring Harbor Protocols | ||
2.5 mM KCl | |||
1 mM NaH2PO4 | |||
1.3 mM MgCl2 | |||
10 mM glucose | |||
TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |