마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

참고 : 모든 동물은 보관 및 기관의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 사용되어야한다. 여기에 설명 된 모든 절차는 케이스 웨스턴 리저브 대학 IACUC에 의해 승인됩니다. 1. 형질 전환 동물 축삭 (네-1 YFP H) (50)와 미세 아교 세포 / 단핵 세포에 라벨을 상업적으로 이용 가능한 형광 기자 마우스를 사용 (CX3CR1 GFP / GFP (51), 물질의 목록 참조). 이 마우스는 교차하고 제도적 동물 보호 정책에 따라 개별 사육 식민지로 유지되어야한다. 2. 골수 키메라 받는 사람 동물로 사용하기에 나이가 적어도 팔주 아르 동물을 식별합니다. 심지어 몸 전체 조사를 위해 위치에 마우스를 개최하도록 설계 원형 조사 잡고 케이지에서 호스트 동물을 놓습니다. 세슘에 타이머를 설정 (CS-137) 조사기는 전신 방사선 도스를 관리 할 수제조업체의 지침에 따라 동물 800 ~ 1,000 RADS의 나이 (여기에 표시된 예는 980 RADS 있습니다). 4 시간의 최소 휴식을 자신의 새장에 동물을 돌려줍니다. 적절한 유전자형의 동물 도너 선택 골수 전구 세포의 소스로 (도 2a 참조). 주 : 해당 기증자가 다른 세포 집단, 또는 컨트롤과 동일한 유전자형 중 하나를 식별하기 위해 호스트에서 다른 혈통 특정 형광 기자를 표현하는 동물이다. 한 페트리 70 % 알코올로 요리, 10 ml의 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 미디어와 미디어에 적신 40 μm의 셀 스트레이너와 두 번째 접시를 입력합니다. RPMI 미디어와 15 ML 원뿔 튜브를 입력합니다. 얼음 요리와 튜브를 유지합니다. 기관의 지침에 따라 공동으로 2 질식을 공여 동물을 희생. 모든 모피가 젖었을 때까지 70 % 에탄올로 전체 동물을 담가 피부와 모피를 청소합니다. SK 제거중반 섹션 주위에 절단 완전히 다리 근육을 노출 뒷다리를 통해 피부를 당겨 동물의 하단에서의. 뼈 탈구 후 멸균 집게와 가위, 껍질을 사용하고 경골의 양쪽 끝에서 떨어져 근육을 잘라 무릎 관절에서 전방 overextension에 의한 경골를 제거합니다. 미디어를 포함하는 페트리 접시 내부의 셀 스트레이너로 전송 한 후 최대 30 초 동안 알코올로 페트리 접시에서 뼈를 놓습니다. 고관절 탈구 및 대퇴골에 붙어있는 근육을 벗겨, 알코올 대퇴골 짧게 배치 한 다음 그릇 안에 동일한 셀 스트레이너에 넣습니다. 조직 배양 후드에서, 뼈의 양 단부를 절단하고 뼈의 단부에 1 ml의 시린지에 21 게이지 바늘을 삽입 멸균 가위를 사용한다. 미디어 15 ML 원뿔에 골수를 플래시합니다. 나머지 뼈의 절차를 반복합니다. 3 ㎖ 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여, 분쇄 뼈 세포 만료페트리 접시에 여과기가 더 세포를 추출. 50 ML 원뿔 튜브의 상단에있는 필터를 놓고 15 ML 원뿔 관에서 흡인 세포와 미디어를 전송할 수 있습니다. 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 골수 호감 플런저의 후면을 사용한다. 15 ML 원뿔 튜브, 뼈 조각과 50 ML 원뿔 튜브에 미디어 30 mL를 셀 스트레이너를 씻으십시오. 펠릿 세포 500 XG에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기. 암모늄 염화 칼륨 (ACK) 2 ㎖로 용해와 적혈구 2 분 동안 용해 완충액. 10 % 소 태아 혈청 함유 배지 10 mL로 용해 버퍼를 켄칭. 500 XG에 5 ~ 10 분간 원심 분리기 펠렛. 각각의 세척을 위해 펠릿 5 ~ 10 분 동안 500 XG에 원심 분리, 식염수에 두 번 RPMI 미디어 10ml에 한 번 세포를 씻으합니다. 식염수 200㎕를 3 × 106 세포의 최종 농도로 세포를 재현 탁. IRR에 꼬리 정맥 주사를 통해 전송 3 × 10 6 골수 세포adiated받는 사람 마우스. 받는 사람 케이지에 산성 액 (PH 3.0)을 놓고 마우스는 복구 할 수 있습니다. 참고 : 이식 시술 후 10-14일 내에서 죽을 것이다 실패 마우스. 8주 후, 유동 세포 계측법 (도 2B-C)를 이용하여 말초 혈액 세포를 면역 검사하여 골수 재구성을 확인. 3. 지느러미 열 압박 손상 참고 : 적절한 키메라 동물이나 원하는 실험에 따라 수술을위한 이중 형질 전환 동물을 선택합니다. 어느 레이블이 거주 또는 골수 유래 세포와 동물은 이전 단계에서 작성되었습니다. 준비하고 rongeurs을 포함하여 수술 도구를 압력솥, 뒤몽 # 4 포셉, 홍채 가위를 들고 조직, 바늘 드라이버와 상처 클립 집게. 통증 조절을위한 마우스에 관리 할 약을 준비합니다. Bupernex와 마르케는 일반적으로 통증 조절을 위해 사용된다. 필요에 따라 적절한 약물을 사용차 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인했다. 4 % 이소 플루 란 마취를 유도하고 분당 60-100 호흡의 호흡 속도를 달성하기 위해 1 ~ 2 %의 이소 플루 란으로 유지한다. 마취하에 건조를 방지하고 발 핀치에 의한 응답의 부족을 확인하기 위해 동물의 눈에 눈 윤활제를 적용합니다. 가열 패드를 사용하여 온도를 유지하고 직장 프로브를 사용하여 온도를 모니터링한다. 대상 척수 수준에 비해 전기 면도기와 마우스의 뒷면을 면도하고 확인을 두 번 70 % 알코올 다음 포비돈 – 요오드와 지역을 세 번 채취. 멸균 드레이프에 동물을 배치하고 수술 부위를 시각화 할 수있는 적절한 위치에서 잘라 구멍이 다른 무균 드레이프와 동물을 커버한다. 수술 전반에 걸쳐 무균 커튼의 모든 도구를 유지한다. 동물의 뒷면에있는 근육을 노출 홍채 가위로 원하는 척수 수준에서 중간 선을 따라 피부를 잘라. DISS에서현미경을 돌출 한 칼라, 승모근 그들은 지느러미 척추 프로세스에 연결 정중선을 따라 넓은 등의 dorsi의 인대를 포함하여 등 근육을 절단하고, 척추를 노출합니다. 특정 척추의 얇은 판을 공개 척추의 지느러미와 가로 프로세스 사이의 회전 근육을 제거하는 것은 (이 경우 T11)을 제거한다. 이 과정 상에 마지막 비 부동 리브의 삽입에 의해 T11을 확인합니다. 제거 할 수있는 공정 위와 아래 공간에 rongeurs의 팁을 삽입하고 있는지 그렇지 않은 척추 부상을 입을 너무 깊은 척추 얇은 판 주위에 위치에 단단히 고정되어 있지만 수 있도록 약간 들어 올립니다. 한 번의 이동 닫기 rongeurs는 얇은 판을 제거합니다. 나머지 척추의 작은 부분을 제거하는 rongeurs를 사용하여 필요에 따라 후궁 절제술을 크게. 통치자에 대해 그들을 잡고 영구 마커로 표시하여 # 4 포셉의 끝에서 1mm를 측정한다. 분리 내기에 1mm를 측정통치자에 대한 집게를 잡고 두 타인을 싸우는와 집게의 샤프트를 통해 장소에 고무 집게 링을 움직여서 1mm에 팁의 최대 폭을 고정합니다. 척수에 액세스 할 수 포셉 타인에 대한 두 개의 삽입 점에서 경질을 통해 30 게이지 바늘을 삽입하여 작은 구멍을 만듭니다. 마크가 경질 이상 확인하고, 포셉의 측면에 표시 1mm의 깊이로 구멍을 통해 경질에 90 ° 각도로 집게 타인을 삽입합니다. 집게를 닫고 10 초 동안 누르고 꼬집어. 릴리스를 반복 집게 세 가지가 보유하고 총 두 번 더 짠다. 척수에서 집게를 제거합니다. 부상 사이트를 통해 생리 식염수 대신 흡수성 젤라틴 압축 스폰지의 조각을 만끽 해보세요. 실행중인 스티치를 사용하여, # 4 합성 비 흡수성 나일론 봉합사와 후궁 절제술을 통해 장소에 근육 적신 젤라틴 스폰지를 봉합. 5mm 상처 CLI를 사용하여 장소에 피부 클립PS. 근육 대전 근 근육에 10 μL 마르케 490 절개 사이트 주위에 식염수를 피하 ㎕의 5 μL Bupernex (0.1 ㎎ / ㎏)에서 (1.0 ㎎ / ㎏)을 주입한다. 동물이 따뜻한 패드에 복구하고 뒷다리의 움직임에 어려움 또는 마비의 징후를 모니터링 할 수 있습니다. 완전히 마취에서 회복 될 때까지 무인 또는 다른 동물의 존재에 동물을 두지 마십시오. 관찰 모터 적자를 표시하는 동물을 사용하지 마십시오. 주 :이 크러쉬 병변 척수의 임의 레벨에서 수행 될 수 있지만, 사실상, T10-L4 호흡 및 클램프를 이용하여 신체의 움직임을 안정화에 대해 이미징 적은 기술적 도전을 제기. 클램프 위치는 흉부 수준에서 이미지에 갈비뼈 주위에 수정해야합니다. 4. 생체 내에 이미징 준비 및 조직, 바늘 D를 유지 뒤몽 # 4 포셉, 홍채 가위, 집게를 포함하여 수술 도구를 압력솥강 상처 클립. 이소 플루 란 이전 마우스를 마취. 4~5%에서 마취를 유도하고 분당 60 ~ 100 호흡의 호흡 속도와 발 핀치에 대한 응답의 부족을 유지하기 위해 필요에 따라 1 ~ 2 %로 유지한다. 가열 된 마우스 이미징 유지하지 호흡 속도를 연속적으로 모니터링하고 직장 프로브 동물 온도를 모니터링. 술 후 상처 베타 딘과 클립과 주변의 피부를 청소하고 제조 업체의 지침에 따라 상처 클립을 제거합니다. 상처 클립이 제거되면, 필요한 경우 나이 르와 머리를 제거하고 포비돈 요오드 70 % 알코올로 사이트를 다시 청소하십시오. 가위로 피부를 다시하는 것은-엽니 다. 근육에 남아있는 모든 봉합사를 제거하고 필요한 경우 가위로 절단, 집게와 떨어져 근육을 당겨. 척수의 위와 아래 라미 척추 하나 척추 레벨에 가로 돌기 측면의 위 근육을 절단함으로써 클램프 해부 현미경 포켓을 만들nectomy. 이러한 척추의 각 주위에 클램프를 놓고 조입니다. 척수에 도달하는 현미경 대물위한 공간을 허용하기 위해 필요에 따라 조정한다. 척수 이미징 플랫폼에 평행 있는지 확인하고, 이미징을위한 조직의 안정성을 유지한다. 호흡 이슈가 보이면, 촬상 필드의 움직임을 최소화하도록 적절하게 클램프 재조정. 파라 필름과 클램프를 커버. , 집게와 척수에서 흡수성 젤라틴 압축 스폰지를 제거 섬세 또한 가능한 한 수막 각지에서 많은 흉터 조직을 제거, 가능한 한 많은 조각을 따기. 필요한 경우 커버 식염수 새로운 스폰지와 척수를 노출. 참고 : 출혈이 스폰지로 물이 새지 필요에 따라 소작하거나, 주변의 근육에서 발생하는 경우. 그러나, 소작와 척수를 건드리지 않도록주의 바랍니다. 소작 때 젖은 티슈 나 젤라틴 압축 스폰지의 조각 중 하나와 척수를 커버. 아 만들기L은 제 척수 홀더의 두 개의 클램프와 동물 측간 잘 구축 치과 아크릴을 사용하여 다음과 Vetbond 피부 및 조직을 봉합에 의해 침지 유체를 보유한다. 아크릴 치료 될 때까지 기다립니다. 인공 뇌척수액 (ACSF)와 잘 채우고 수술 사이트 주위에 출혈 어떤 다시 확인합니다. 선택적으로,이 시점에서 촬상 중에 혈관 강조 꼬리 정맥 주사에​​ 의한 정맥 혈관 형광 염료를 주입. 참고 : 양자 점과 형광 표지 된 렉틴이 또한 유용 선박 염료를 제공하지만 70 kDa의 위의 형광 덱스 트란이 자주 사용된다. 150,000 WM TRITC 덱스 트란 50 μL은 전형적 정맥 내 주사된다. 생리 학적으로 중요한 면역 세포 운동성을 구하려면 마우스의 온도는 37 ° C로 유지되어야한다. 이미징 현미경으로 온도 제어 된 환경에 마우스를 이동하고 올바른 anes의 동물을 모니터링호흡 속도와 발 핀치에 의해 thesia 수준. 분당 100 호흡 – (60)의 호흡 속도를 달성하는 것을 목표로, 마취의 깊이를 결정하기 위해 촬영시 자주 동물을 모니터링합니다. 현미경의 접안 렌즈를 통해 영상 사이트를 찾습니다. 동적 촬상 데이터를 얻는 Z 스택 화상마다 30-60 초 걸릴 2- 광자 레이저 주사 현미경을 조정한다. 영상 세션이 완료되면 가열 상자에서 동물을 제거합니다. 척추 클램프를 풀고 클램프에서 마우스를 제거합니다. 클램프를 제거하는 동안 피부에서 잘 떨어져 아크릴을 당깁니다. 마우스가 다시 영상화 할 경우, 척수를 통해 식염수를 적신 젤라틴 압축 스폰지를 배치합니다. 수술 사이트를 통해 근육과 피부를 닫습니다. 마취에서 회복하는 동안 무인 동물을 떠나거나 다른 동물의 존재하지 않습니다. 동물이 복구 후 신경 학적 결손의 흔적을 표시하는 경우, 동물은 안락사해야합니다. 그렇지 않으면 안락사CO 2 챔버 내의 마우스 그것은 IACUC 승인 안락사 프로토콜에 따라 전에 마취에서 나온다. 제조업체의 지시에 따라 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 이미지를 분석한다.