Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.
Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.
De ontstekingsreactie ziekte of letsel in het centrale zenuwstelsel (CZS) wordt slecht begrepen, vooral met betrekking tot de interacties tussen immune woonachtig cellen in het weefsel. Onderzoeken van deze cellulaire interacties in het ruggenmerg van bijzonder belang in het levende dier. De enige gemakkelijk bereikbaar CNS kwestie darmkanaal wit is in de dorsale kolommen van het ruggenmerg, waardoor dit een belangrijk gebied waarop de inspanningen op het verbeteren van haalbare experimentele aanpak richten. Deze onderzoeken zijn beperkt vanwege de technische problemen bij de toegang tot en het stabiliseren van de CNS voor beeldvorming. Live beeldvorming in het ruggenmerg beschreven eerder 1-13 echter weinig studies gericht cellulaire beweging ruggenmergletsel dan enkele uren na de eerste insult. De traumatische dwarslaesie is een complexe omgeving, met neuronen, astrocyten, fibroblasten, NG2 voorlopercellen, en immuuncellen including microglia, neutrofielen, macrofagen, T-cellen, B-cellen en dendritische cellen 14,15. Macrofagen zijn de subset van immuuncellen verantwoordelijk voor fagocytose in de laesie, infiltreren uit de circulatie. De rol van deze fagocyten is besproken, met berichten dat deze cellen zowel schadelijke en beschermende rol in het gewonde weefsel kan nemen. Deze rollen variëren van toenemende secundaire axonale dieback na een blessure en handelen op een fagocyterende manier 16-22, aan het nemen op een wondgenezing fenotype en het verminderen van functionele tekorten in de gewonde dier 21,23,24.
Eerder pogingen om macrofagen uit microglia hebben voornamelijk op de morfologie in gezond weefsel te onderscheiden. Echter, geactiveerde microglia en macrofagen tot expressie veel van dezelfde merkers en weer onderscheiden morfologie na verwonding 25-29, waardoor de scheiding van verschillende activiteiten van deze cellen moeilijk bas bestuderened op deze factoren alleen al 30. Deze cellen kunnen worden gescheiden door differentiële expressie van CD45 middels flowcytometrie 33,34, hoewel deze aanpak minder bruikbaar bij het discrimineren deze celtypes in vivo. Gebruik makend van differentiële expressie van CCR2 en CX3CR1 in microglia en macrofagen werd ook onderzocht, maar de dynamische veranderingen in de expressie van deze markers monocyten differentiëren tot macrofagen nauwkeurige analyse 35,36 compliceren. Microglia zijn de bewoner immuuncellen in het CZS en staat op uit de dooierzak voorouders tijdens de foetale ontwikkeling, terwijl de macrofagen zijn afgeleid uit beenmerg voorouders en voer de gewonde CNS na een belediging 31,32. Een alternatieve benadering voor het gebruik morfologie deze twee celtypen te onderscheiden is het beenmerg progenitoren vervangen van een donordier expressie traceerbare marker in de macrofagen afkomstig van de donor stamcellen behoud van de hersencellen, recip-seerde afgeleide microglia. Deze beenmerg chimere modellen worden vaak gebruikt in vele andere toepassingen 37-40. Deze methode heeft unieke restricties op schade aan de integriteit van de bloed-hersenbarrière veroorzaakt door bestraling of cytotoxische geneesmiddelen tegen beenmerg progenitoren roeien in de gastheer, waardoor het gebruik ervan in bepaalde toepassingen beperken. Onlangs, functionele verschillen tussen microglia en macrofagen in de CNS beginnen te worden onderscheiden met behulp van flowcytometrie, gen-chip array analyse en chimerisme methoden 24,26,41-44, die zeer nuttig zijn in de toekomst zal blijken. Hoewel het scheiden van deze twee soorten cellen blijft moeilijk, het begrijpen van hun unieke functies is belangrijk in het leiden tot meer gerichte behandelingen van aandoeningen die zowel microglia en macrofagen in het CZS te betrekken.
Beschrijving van cellulaire interacties binnen de dwarslaesie is voornamelijk afkomstig uit studies met celcultuur modellen. Dit is dUE op de uitdagingen bij beeldvorming zowel het ruggenmerg laesie en immuuncellen samen in een levend dier. Huidige knaagdier modellen van dwarslaesie van verschillende aard en de ernst bevatten kneuzing modellen 45,46, pin prik verwondingen 2, laceratie 47, en de dorsale kolom crush hier 16,18,48 beschreven. Ontsteking in de hersenvliezen neemt toe met de ernst van de verwonding en vormt unieke uitdagingen voor de implantatie van vensters en operaties voor seriële imaging. Sommige van deze uitdagingen zijn de infiltratie van fagocyterende cellen alsmede de vorming van vezelig weefsel op de operatieplaats. Sommige van deze problemen kunnen worden overwonnen door het creëren van kleinere laesies en die de blootgestelde ruggenmerg met niet-immunogene chirurgische bandages tussen de dura en de paraspinous spieren om voor latere heropening chirurgie, zoals hier gedaan om de dorsale kolom verbrijzelingsletsel bestuderen . De mogelijkheid om het beeld alleen het dorsale gedeelte van de spinal koord beperkt ook de keuze van de schade, aangezien contusie modellen eerste beschadiging van het centrale snoer, dikwijls spaarde de dorsale deel van de dorsale kolommen, vooral op vroege tijdstippen na verwonding 45,49. Daarom beschrijven we een eenvoudige traumamodel dat een schone, herhaalbare, rechthoekig gevormde laesie die bruikbaar zijn voor zowel de waarneming van celbeweging in de laesie en eenvoudige kwantificering van axonale ten opzichte van de laesie oplevert.
Beeldvorming interacties van verschillende celtypes in hun eigen weefsel compartimenten tijdens daaropvolgende pathologie in real-time heeft grote belangstelling gegenereerd. Binnen het dichte net van de CNS, cel-cel contact en signalering met aangrenzende cellen zijn essentieel voor de normale functie en voor het begrijpen van CZS pathologie. Hier beschrijven we het gebruik van 2-foton laser scanning microscopie voor waarneming van cellulaire verkeer binnen een mechanische laesie in het ruggenmerg. Naast de kwaliteit van de chirurgie en weefselbereiding, mechanische stabiliteit van het weefsel is essentieel voor een succesvolle time-lapse microscopie, met name de isolatie van het ruggenmerg inademt bewegingsartefacten. Stabiliteit kan worden beoordeeld door te kijken voor beweging van het ruggenmerg onder een dissectie microscoop die overeenkomt met de hartslag en ademhaling van het dier. Stabiliteit moeten worden beoordeeld, zowel tijdens het uitvoeren van de operatie en ook onmiddellijk voor het begin van beeldvorming. Als de animal is niet stabiel, aanpassingen moeten worden gedaan om de plaatsing en de dichtheid van het ruggenmerg klemmen. Celtype specifieke fluorescente reporter muismodellen combinatie met beenmerg hersenschim benaderingen hebben toegelaten dat de identificatie van monocytcellen versus microglia en axonen. Eerdere studies hebben aangetoond dat op basis van bloed monocyten en niet microglia zijn verantwoordelijk voor secundaire axonale schade na trauma met behulp van de hier 43 beschreven methode. Dextran geconjugeerde kleurstof vat zorgt voor identificatie van het vaartuig, zowel aan bezienswaardigheden te bieden en om inbreuken op de integriteit vaartuig te identificeren. De keuze van de geschikte fluorescente reporter muismodel cruciaal om de juiste identificatie van het gewenste celtypes te beelden.
Ontwikkeling van fluorescente muismodellen die voor de studies ondernomen zijn ook cruciaal voor het succes van experimenten. Onderscheid te maken tussen de twee fagocytisch populaties van CX3CR1 + / GFP </sup> Cellen in het CZS traditioneel moeilijk. Zoals hier getoond, kan een gemeenschappelijke immunologische techniek bestraling chimeren, worden gebruikt om radio-resistente, CNS-resident microglia onderscheiden van beenmerg afgeleide macrofagen. De bestraling procedure heeft de potentie om de bloed-hersenbarrière beschadigen en veranderen celfenotypen, zodat het gebruik van dit model moet zorgvuldig worden overwogen. De omvang van deze veranderingen verschilt met stralingsdosis evenals de duur van de herstelperiode, en hun impact op verschillende inflammatoire modellen is nog niet volledig onderzocht. De effecten van bestraling op CNS bloedhersenbarrière kan worden geminimaliseerd door het afschermen van de kop tijdens bestraling en dit is aangetoond dat infiltratie te verminderen in het ruggenmerg na bestraling, zelfs wanneer het ruggenmerg niet direct afgeschermd 52. Hier hebben we vastgesteld dat het aantal cellen infiltreren in het CZS bij steady state als gevolg van chimeer generatie onbeduidend in tegenstelling tot het gevoellooser cellen die in de laesie. Andere alternatieve modellen te beschouwen, omvatten drugs veroorzaakte chimera 52 of parabiotic muismodellen 53.
Hier tonen we een specifieke, eenvoudige en reproduceerbare kleine letselmodel die resulteert in een laesie op het dorsale witte stof van het ruggenmerg die gemakkelijk beeld met de 2-foton microscopie. Deze werkwijze verschaft ook een meetbaar laesie om de mate van axonale zullen verdwijnen in de dorsale kolommen die in de literatuur is gekoppeld met aanvullende vaste weefselonderzoek 16,18,43,48,54 assay. In dit model, dieren geven slechts minimale tekorten en vereisen geen speciale zorg na een blessure. Toekomstige onderzoeken waarin de dorsale kolom crush en beeldvormende technieken die hier beschreven zijn krachtige screening hulpmiddelen om de werkzaamheid van behandeling van ruggenmergletsel beoordelen. Deze behandelingen kunnen bestaan uit kleine molecule inhibitoren, drugs, mobiele producten, weefseltransplantaten en combinatorische behandelings. De wisselwerking tussen macrofagen, microglia en neuronen waarschijnlijk ook een rol bij andere ziektemodellen in het ruggenmerg, waaronder multiple sclerose, tumors, meningitis en amyotrofe laterale sclerose spelen, en deze techniek kan bruikbaar zijn in de studie van dergelijke ziekten en .
The authors have nothing to disclose.
The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
60mm2 petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
Falcon 40 um cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
1x15mL and 1x50mL conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
16 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
1ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
HBSS | Gibco | 1E+07 | For bone marrow isolation |
RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
30-gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9E+06 | For imaging |
4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
Reflex Clips, 7mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
Marcaine | Henry Schein | 6E+06 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mm NaCl | For surgery |
26.2 mM NaHCO3 | From Cold Spring Harbor Protocols | ||
2.5 mM KCl | |||
1 mM NaH2PO4 | |||
1.3 mM MgCl2 | |||
10 mM glucose | |||
TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |