Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.
Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.
ومن المفهوم رد فعل التهابي للمرض أو إصابة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) سيئة، وخاصة فيما يتعلق التفاعلات بين الخلايا المناعية والمقيمين داخل الأنسجة. التحقيقات في هذه التفاعلات الخلوية في الحبل الشوكي هي ذات أهمية خاصة في حيوان حي. وفقط يمكن الوصول إليه بسهولة CNS الأبيض مسألة المسالك في الأعمدة الظهرية للنخاع الشوكي، مما يجعل هذه المنطقة الهامة التي لتركيز الجهود على تحسين المنهج التجريبي ممكنا. وكانت هذه التحقيقات محدود بسبب صعوبة التقنية في الوصول وتحقيق الاستقرار في الجهاز العصبي المركزي للتصوير. وقد وصفت التصوير ناري في الحبل الشوكي حركة الخلوية سابقا 1-13، ومع ذلك، فقد تناول عدد قليل من الدراسات في إصابة الحبل الشوكي وراء بضع ساعات بعد إهانة الأولية. الآفة الحبل الشوكي المؤلمة هي بيئة معقدة، مع الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، الخلايا الليفية، الخلايا الاصلية NG2، والخلايا المناعية includiنانوغرام الخلايا الدبقية الصغيرة، العدلات، الضامة، والخلايا T، خلايا B والخلايا الجذعية 14،15. الضامة هي مجموعة فرعية من الخلايا المناعية المسؤولة عن البلعمة في الآفة، التسلل من التداول. وقد تم مناقشة دور هذه الخلايا البلعمية، مع تقارير تشير إلى أن هذه الخلايا يمكن أن تتخذ على كل من الأدوار الضارة واقية في الأنسجة المصابة. وتتراوح هذه الأدوار من زيادة السقم المحاور الثانوية بعد إصابة والتصرف بطريقة أكلة 16-22، ليأخذ على التئام الجروح النمط الظاهري وخفض عجز وظيفي في الحيوان المصاب 21،23،24.
في السابق، ومحاولات لتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة الضامة من اعتمدت في المقام الأول على التشكل في الأنسجة السليمة. ومع ذلك، الخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها والضامة تعبر عن العديد من نفس علامات وعرض مورفولوجيا تمييزه بعد إصابة 25-29، مما يجعل الفصل بين الأنشطة المختلفة من هذه الخلايا صعبة لدراسة بسإد على هذه العوامل وحدها 30. هذه الخلايا يمكن فصلها عن طريق التعبير التفاضلية من CD45 باستخدام التدفق الخلوي 33،34، على الرغم من أن هذا النهج هو أقل فائدة في تمييز أنواع الخلايا هذه في الجسم الحي. كما تم استكشاف استخدام التعبير التفاضلية من CCR2 وCX3CR1 في الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة، على الرغم من التغيرات الدينامية في التعبير عن هذه العلامات كما حيدات تفرق في الضامة يمكن تعقيد تحليل دقيق 35،36. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمين في الجهاز العصبي المركزي وتنشأ من الأسلاف الكيس المحي أثناء التطور الجنيني، في حين مستمدة من الأسلاف الضامة نخاع العظم وأدخل CNS المصاب بعد إهانة 31،32. نهج بديل لاستخدام التشكل التمييز بين هذه أنواع الخلايا اثنين هو استبدال نخاع العظام مع الأسلاف من حيوان المانحة تعبر عن علامة يمكن تتبعها في الضامة المستمدة من الأسلاف المانحة، مع الحفاظ على المقيمين CNS، رجب-ient المستمدة الخلايا الدبقية الصغيرة. وتستخدم هذه النماذج خيالية نخاع العظام شائع في العديد من التطبيقات الأخرى 37-40. هذا الأسلوب له المحاذير الفريدة المرتبطة الأضرار التي لحقت سلامة حاجز الدم في الدماغ الناجم عن أشعة أو السامة للخلايا الأدوية المستخدمة للقضاء على الأسلاف نخاع في البلد المضيف، مما يحد من استخدامها في تطبيقات معينة. في الآونة الأخيرة، الفروق الوظيفية بين الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في الجهاز العصبي المركزي هي بداية لتمييزها باستخدام التدفق الخلوي، وتحليل مجموعة رقاقة الجينات وطرق الخيمرية 24،26،41-44، والتي سوف تكون مفيدة جدا في المستقبل. على الرغم من أن فصل هذه الأنواع الخلية اثنين لا يزال صعبا، فهم وظائف فريدة من نوعها المهم في المؤدية إلى علاجات أكثر استهدافا من الاضطرابات التي تنطوي على كل من الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة داخل الجهاز العصبي المركزي.
وصف التفاعلات الخلوية داخل الآفة الحبل الشوكي قد حان في المقام الأول من دراسات شملت نماذج ثقافة الخلية. هذا هو درق إلى التحديات المرتبطة التصوير كل من آفة في الحبل الشوكي والخلايا المناعية معا في الحيوانات الحية. وتشمل نماذج القوارض الحالية للإصابة الحبل الشوكي من نوع وشدة متفاوتة نماذج كدمة 45،46، إصابات وخز دبوس 2، تهتك 47، والظهرية إصابة العمود سحق الموصوفة هنا 16،18،48. التهاب السحايا في يزيد مع شدة الإصابة ويطرح تحديات فريدة من نوعها لزرع النوافذ أو العمليات الجراحية للتصوير المسلسل. بعض هذه التحديات تشمل تسلل الخلايا البلعمية، وكذلك توليد الأنسجة الليفية عبر موقع الجراحية. بعض هذه القضايا يمكن التغلب عليها من خلال خلق الآفات الصغيرة والتي تغطي النخاع الشوكي يتعرض مع الملابس الجراحية غير مناعة بين الجافية والعضلات paraspinous للسماح لجراحة إعادة فتح اللاحقة، كما هو الحال هنا لدراسة ظهري العمود إصابة سحق . القدرة على صورة فقط الجزء الظهري من زيادة ونقصانكما يحد الحبل آل اختيار الإصابة، منذ نماذج كدمة تسبب في المقام الأول الأضرار التي لحقت الحبل المركزي، وغالبا ما تشفق على الجزء الأكثر الظهري من الأعمدة الظهرية، وخصوصا في نقاط زمنية مبكرة بعد اصابة 45،49. لذلك، نحن تصف نموذجا إصابة بسيط هو أن تعطي، قابلة للتكرار، الآفة على شكل مستطيل نظيفة يمكن أن يكون مفيدا لكل من مراقبة حركة الخلية داخل الآفة والكمي سهل من موقف محور عصبي نسبة إلى الآفة.
التفاعلات التصوير من أنواع مختلفة من الخلايا في مقصورات الأنسجة الأم أثناء تلت ذلك علم الأمراض في الوقت الحقيقي ولدت اهتماما كبيرا. ضمن شبكة كثيفة من الجهاز العصبي المركزي، خلية خلية الاتصال و الإنذار مع الخلايا المجاورة ضرورية لالوظيفة العادية ولفهم CNS علم الأمراض. هنا، وصفنا استخدام 2 الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر لمراقبة الحركة الخلوية داخل الآفة الميكانيكية في الحبل الشوكي. وبالإضافة إلى نوعية إعداد الجراحة والأنسجة، والاستقرار الميكانيكي للأنسجة أمر بالغ الأهمية لنجاح المجهري الوقت الفاصل، وخاصة عزل الحبل الشوكي من التنفس الحركة قطعة أثرية. يمكن تقييم الاستقرار من خلال البحث عن حركة الحبل الشوكي تحت المجهر تشريح الذي يتوافق مع معدل ضربات القلب أو التنفس من الحيوان. ينبغي تقييم الاستقرار على حد سواء أثناء أداء الجراحة وأيضا على الفور قبل البدء في التصوير. إذا كان أنيمال ليست مستقرة، وينبغي بذل تعديلات على التنسيب وضيق من المشابك الحبل الشوكي. وقد سمحت الخلية من نوع نماذج الفلورسنت معين مراسل الماوس إلى جانب النهج الوهم نخاع العظام تحديد خلايا الوحيدات مقابل الخلايا الدبقية الصغيرة ومحاور عصبية. وقد كشفت الدراسات السابقة أن الدم المستمدة حيدات الخلايا الدبقية الصغيرة وليس مسؤولة عن الأضرار محور عصبي بعد الصدمة الثانوية باستخدام المنهجية الموصوفة هنا 43. ديكستران مترافق صبغ السفينة يسمح للهوية السفينة على حد سواء لتوفير المعالم وتحديد المخالفات في سلامة السفينة. اختيار الفلورسنت نموذج مراسل الماوس المناسب أمر حاسم للسماح التحديد السليم من أنواع الخلايا المراد تصويرها.
تطوير نماذج الماوس الفلورسنت التي تتناسب مع الدراسات التي يجري الاضطلاع بها أمر بالغ الأهمية لنجاح التجارب أيضا. التمييز بين اثنين من السكان أكلة من CX3CR1 + / GFP </sup> الخلايا في الجهاز العصبي المركزي تقليديا صعبا. كما هو موضح هنا، وهي تقنية المناعية المشتركة، الوهم التشعيع، ويمكن أن تستخدم للتمييز مقاومة للراديو، الخلايا الدبقية الصغيرة CNS المقيمين من البلاعم المشتقة من نخاع العظام. إجراء أشعة لديه القدرة على إلحاق الضرر حاجز الدم في الدماغ وتغيير الظواهر الخلية، لذلك ينبغي النظر في استخدام هذا النموذج بعناية. مدى هذه التغييرات يختلف مع جرعة التشعيع وكذلك مدة فترة النقاهة، وتأثيرها على نماذج التهابات مختلفة لم يتم دراستها بشكل كامل. آثار الإشعاع على الجهاز العصبي المركزي حاجز الدم في الدماغ يمكن التقليل من يحمي الرأس أثناء التشعيع، ولقد ثبت هذا لتقليل تسلل خلية في الحبل الشوكي بعد التشعيع، حتى لو كان الحبل الشوكي لا محمية مباشرة 52. هنا لاحظنا أن عدد الخلايا التسلل الى الجهاز العصبي المركزي في حالة مستقرة نتيجة لجيل الوهم غير ذات أهمية على النقيض من خدرإيه الخلايا دخول الآفة. وتشمل نماذج بديلة أخرى للنظر في الوهم المخدرات التي يسببها 52 أو نماذج الماوس التعايش الالتصاقي 53.
هنا، قدمنا نموذجا إصابة صغيرة محددة وبسيطة وقابلة للتكرار في ذلك من آفة إلى المادة البيضاء الظهري للحبل الشوكي أن من السهل أن الصورة باستخدام المجهر 2 الفوتون. يوفر هذا الأسلوب أيضا آفة قابلة للقياس الكمي لفحص درجة السقم محور عصبي في الأعمدة الظهرية أنه في الأدب وقد يقترن مكملة الأنسجة الثابتة تحليل 16،18،43،48،54. في هذا النموذج، عرض الحيوانات فقط الحد الأدنى من العجز ولا تحتاج إلى رعاية خاصة بعد الاصابة. الدراسات المستقبلية باستخدام تقنيات إصابة العمود سحق والتصوير الظهرية الموصوفة هنا قد تكون أدوات الفحص قوية لتقييم فعالية العلاج لإصابة الحبل الشوكي. ويمكن أن تشمل هذه العلاجات مثبطات جزيء صغير، والمخدرات، ومنتجات الخلية، وترقيع الأنسجة والعلاج اندماجيالصورة. التفاعل بين الضامة، الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية ومن المرجح أيضا أن تلعب دورا في نماذج المرض أخرى في الحبل الشوكي، بما في ذلك التصلب المتعدد، والأورام والتهاب السحايا والتصلب الجانبي الضموري، وربما يكون هذا الأسلوب مفيدا في دراسة هذه الأمراض وكذلك .
The authors have nothing to disclose.
The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
60mm2 petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
Falcon 40 um cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
1x15mL and 1x50mL conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
16 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
1ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
HBSS | Gibco | 1E+07 | For bone marrow isolation |
RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
30-gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9E+06 | For imaging |
4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
Reflex Clips, 7mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
Marcaine | Henry Schein | 6E+06 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mm NaCl | For surgery |
26.2 mM NaHCO3 | From Cold Spring Harbor Protocols | ||
2.5 mM KCl | |||
1 mM NaH2PO4 | |||
1.3 mM MgCl2 | |||
10 mM glucose | |||
TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |