Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices
Summary
Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.
Abstract
Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.
Introduction
Glutamat-receptorer medierar majoriteten av excitatorisk synaptisk transmission vid centrala nervsystemet synapser. De två viktiga subtyper av jonotropiska glutamatreceptorer lokaliserade i ryggrad huvudet av det postsynaptiska membranet är N-metyl-D-aspartat (NMDA) och α-amino-3-hydroxi-5-metylisoxazol-4-proprionsyra (AMPA) receptorer. Vid vila membranpotentialer, AMPA receptorer bär de flesta av de postsynaptiska ström under synaptisk transmission. I hippocampus spelar NMDA-receptorn en viktig roll för att utlösa förändringar i antalet AMPA-receptorer i postsynaptiska membranet: genom att agera som en "tillfällighet detektor" 1 för att initiera förändringar i synaptisk styrka 1, deltar NMDA-receptorn i synaptiska mekanismerna som är tänkt att stödja inlärning och minne på en subcellulär nivå. Som svar på depolarisering av den postsynaptiska neuron parallellt med frisläppandet presynaptisk sändare, går kalcium via NMDAreceptor att inleda AMPA receptor insättning eller borttagning 2. Dessa receptordynamik ligger bakom synaps plasticitet: en ökning av synaptisk styrka är långsiktig potentiering 2,3 (LTP), medan en minskning i synaptisk styrka är långvarig depression 4 (LTD). Därför AMPA-receptorrörelse tros vara ansvarig för synaptisk plasticitet uttryck, medan NMDA-receptorer tros reglera sin induktion.
Fastställande av exakta mekanismerna synaptisk transmission och plasticitet underliggande kräver att studera små populationer av synapser, helst enstaka synapser. Medan vissa synapser är mycket lämpad för studier på denna nivå, till exempel, den Calyx av Held 5, för de flesta synaptiska populationer detta är extremt svårt på grund av de små och diffusa karaktären av de synapsförbindelser. Två större elektrofysiologiska tekniker har utvecklats för att undersöka enskilda synapsförbindelser: Den första är minimal stimulans, where en presynaptisk fiber antas stimuleras extracellulärt. Den andra tekniken är parad inspelningar, där två samtidiga hela cell inspelningar från synaptically anslutna nervceller utförs. En stor fördel med minimal stimulering är att den är snabb och relativt enkla att utföra, som involverar placering av en extracellulär stimulerande elektrod i axonal tarmkanalen samtidigt inspelning från en postsynaptisk neuron. Det viktigaste när man använder denna teknik är att tillförlitlig stimulering av en enda cell sällan kan garanteras rättegång efter rättegång.
Under de senaste femton åren har vi rutinmässigt används parat hel-cell inspelningar från två synaptically anslutna pyramidala nervceller 6-17. Den stora fördelen med denna teknik är att endast ett presynaptiska neuronen är konsekvent och tillförlitligt sätt stimuleras. Det gör också inte bara elektrofysiologiska karakterisering utan även farmakologisk manipulation av presynaptiska neuron 6,18 </ Sup>. Emellertid är sannolikheten för synaptisk konnektivitet mellan neuroner låg, vilket gör anslutna parvis svårt att erhålla 19. Användningen av organotypiska hjärn slice kulturer kringgår detta hinder som synaptiska uppkoppling kan återupprätta in vitro och dessutom vilken typ av resulte anslutning liknar den i normal hjärnvävnad 20. Dessutom organotypiska kulturer uttrycker LTP, LTD 7-10,12-15,21 och ytterligare former av kortsiktiga synaptisk plasticitet inklusive parade puls underlättande (PPF) och depression (PPD) 6,22,23, vilket möjliggör plasticitet mekanismer för att studeras i par av neuroner. Här beskriver vi de specificerade metoder involverade i framgångsrikt uppnå parade inspelningar i detta in vitro-system. Denna information kan lätt anpassas till andra experimentella system, inklusive akut skivor och andra hjärnregioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi beskrivit kraven för upprättande framgångsrika parade hela cell inspelningar i organotypic hippocampus slice kulturer. Kopplade inspelningar kan också utföras i flera preparat, inklusive akut skivor och dissocierade odlingssystem 26,27. Medan fokus här har varit på induktion av längre former av synaptisk plasticitet (dvs. LTP och LTD), är det viktigt att framhäva att parade hela cell inspelningar i organotypisk, akut skiva och dissocierade cellpreparat har gett viktiga insikter i quantal…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.
Materials
| Organotypic cultures | Paired recordings | ||
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 filter paper | Faraday cage | ||
| #5 forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation – A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down’s syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
